不明病因腹泻儿童新型致病病毒的挖掘研究

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1、科技专项：计划类别：社会发展指南代码：常州市科技计划项目申报书(科技支撑计划--社会发展)项目名称：不明病因腹泻儿童新型致病病毒的挖掘研究承担单位：所在地区：单位地址：邮编：项目负责人：电话：主管部门：常州市科学技术局二○一三年21一、立项依据和目标1、本课题研究意义及同类研究工作国内外研究现状、知识产权状况与存在问题，并列出主要参考文献腹泻是全球重要的公共卫生问题，是感染性疾病中引发死亡的第三位病因。报道显示，在世界范围内，每年有近15亿人腹泻，导致150-250万5岁以下腹泻儿童死亡，尤其是在发展中国家因腹泻死亡儿童占有较大的比例[

2、1]。据报道每年平均每个儿童腹泻约3.2次，但在一些发展中国家每年每个儿童可腹泻高达12次腹泻病[2,3]急性腹泻是儿童的常见病和多发病，尤其在发展中国家，是导致婴幼儿死亡的主要原因之一，其病因主要是病原微生物感染。既往研究提示大部分急性腹泻为感染性腹泻，一般由不同的病原体引起，包括细菌、病毒和寄生虫。病毒引起大多数散发或暴发急性腹泻[4]。2009年全国报告腹泻病例中，提供病原学诊断信息的病例有33,087例，其中病毒性感染30,703例(占92.79%)[5]。研究者已在腹泻病人粪便中检测到不同病毒，在已确定为腹泻病原体的病毒中，轮

3、状病毒（Rotaviruses，RV）、人类杯状病毒（HumanCaliciviruses，HuCV），肠道腺病毒（EntericAdenoviruses，EAd），星状病毒（Astroviruses，AstV）是最常见的引起婴幼儿腹泻的病毒；此外冠状病毒、小RNA病毒、小双节RNA病毒、细小病毒等也可能引起腹泻。随着抗生素的广泛应用，饮水和卫生条件的改善，细菌和寄生虫所致腹泻得到了有效控制，而病毒引起的腹泻却并未减少，逐渐受到人们的重视。目前，现有的医疗检测手段只能诊断出60%的腹泻病例的病因，而近40%的病例仍然查不出病因[6,7]

4、，引起未知病因腹泻的罪魁祸首，可能是暂未被发现的病毒。目前，对于细菌性和传统的病毒性腹泻，人类并不感到万分恐慌，因为人类已经开发大量的用于治疗细菌性腹泻的抗生素，用有效的疫苗及抗体来预防和治疗传统的病毒性腹泻。人类及动物消化道中存在庞大的病毒群落，而目前人类所了解的消化道病毒还只是冰山一角，绝大多数的病毒是未知的。面临新发病毒性腹泻,目前人类还没有特殊的预防和治疗措施。因此,人类想要征服新发病毒性传染病，只有提前挖掘潜在的致病性新病毒，并针对新病毒进行基因组分析、流行病学调查、疫苗和治疗抗体的开发等方面的研究，从而为病毒性腹泻防控、临床

5、治疗等提供理论基础和技术支持。对于未知病毒的鉴定，传统的研究方法的局限于电镜、PCR、细胞培养及特异抗体等。但是上述的方法受限于：（1）电镜操作繁琐、灵敏度低、仅能从形态上初步推断；（2）常规的PCR21方法只能扩增已知病毒或者用兼并引物检测同一种属的低变异的病毒，但很难检测到高变异的新病毒；（3）细胞培养结合其它检测方法能鉴定已知的病毒，但同样很难鉴定新病毒，而且大多数病毒不能用细胞培养；（4）难于获得新病毒的特异抗体。近年来，随着分子生物学技术的发展及挖掘新病毒的需求，大量的分子生物学检测病毒的方法被应用到挖掘新病毒的研究中，如随机

6、引物扩增法（ArbitrarilyprimedPCR，AP-PCR)、代表性差异筛选法（Representationaldifferenceanalysis，RDA）、微阵列（Microarrays）、单引物非依赖核酸序列扩增（Sequence-independentsingleprimeramplification，SISPA）、PhiX29DNA聚合酶扩增、滚环扩增（Rollingcircleamplification，RCA）及病毒宏基因组法（ViralMetagenomics），而其中病毒宏基因组法越来越成为人类挖掘新病毒的强大

7、工具[8-10]。病毒宏基因组学是宏基因组学的另一分支，指研究特定环境中病毒群落的一门新技术。2005年,Edwards首次提到病毒宏基因组学这一概念，其描述的是环境中的病毒群落——噬菌体。最早应用宏基因组学理论分析病毒群落的科学家是Breitbart教授，他应用鸟枪测序法（shotgunsequencing）首次对美国加州海岸的海洋中病毒群体进行研究[11]，发现374-7114个潜在的新病毒，他是最早应用宏基因组学分析人粪便中不能培养的病毒群落的科学家之一.对于腹泻潜在致病病毒的挖掘方面，病毒宏基因组学已经有了初步应用，美国学者Fi

8、nkbeiner等通过对18份急性腹泻样品进行核酸提取和随机引物逆转录之后构建质粒文库，并从每个文库中挑取384个克隆进行测序，其中35.6%的克隆为病毒序列[6]，但是该研究之前并没有对样品进行已知致病因