人多肽：n-乙酰氨基半乳糖转移酶2（ppgalnact2）正义与反义表达载体地构建及其功能地初步研究

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1、^圳tiN．厶酰钮蓼半乳糖转移酶2(ppG'alNAcT2)正义与反义表达载体的掏建及坚些堑堕塑生鲨塞垫堑人多肽：N．乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAcT2)正义与反义表达载体的构建及其功能的初步研究摘要人ppGalNAcT2属多肽：N．乙酰氨基半乳糖转移酶家族成员，为II型膜蛋白，分子量约为64．7kD，编码571个氨基酸。人的多肽：：N．乙酰氨基半乳糖转移酶一2(ppGalNAc—T2)是1995年由White和Clauson从人胎盘中提纯出来。进一步以部分氨基酸序列为基础，再从人胃癌细

2、胞的kgtlOcDNA文库中克隆了ppOalNAe—T2，其编码区为1713个bp，基因定位于lq41-q42。人ppGalNAcT2具有广泛的表达谱，主要表达于结肠、小肠、胃、胰腺、骨骼肌、睾丸和卵巢等组织器官。多肽：N一乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAcT)催化O，聚糖合成的第一步反应，将UDP．OalNAc上的OalNAc基团转移至蛋白多肽链上特定序列中的Thr或Ser从而合成GalNAcn．O—Ser／Thr。肿瘤细胞表面可有类似粘蛋白的糖蛋白，在肿瘤的转移和浸润生长过程中起着重要的作

3、用，而粘蛋白含有丰富的0一糖基化结构域，因此多肽：N一乙酰氮基半乳糖转移酶(ppGalNAc．T)及其家族作为粘蛋白O-糖基化的起始酶可能与肿瘤的发生发展密切相关。ppGalNAc—T2是该家族中组织分布及底物谱较广的成员，很有可能是D一糖链合成的限速酶，有着重要的生物学意义，故本文以此酶作为研究对象初步探讨其功能。1．ppGalNAc．T2在不同细胞的表达及其基因家族在两种肿瘤细胞中mRNA表达谱分析采用RT-PCR方法，检测六种肿瘤细胞中ppGalNAC—T2的表达情况，结果表明ppGalNA

4、C．T2是一个广泛表达的基因，在神经胶质瘤细胞、胃癌细胞、自血病细胞、人肺腺癌细胞、人卵巢癌细胞中都有不同程度的表达，同时以p-actin作为内参对照，显示其在胃癌细胞中表达最高，在神经胶质瘤中表达较低，而在成纤维细胞NIH3T3中不表达或少量表达。同样方法检测多肽：N．乙酰氨基半乳糖转移酶家族在人神经胶质瘤细胞株SHG44和人胃癌细胞株GC7901的mRNA表达情况。结果显示SHG44l^多肚；N．己酰氢基半乳糖转移酶2(ppGalNAcT2)正义与反义表达载体的构建盈冀功能的初步魉墨细胞株中p

5、pGalNAcT2、T6、T8、T10、T11、T13和SGC7901细胞株中ppGalNAcT2、T4、T7、T8、T11、T13有不同程度表达。2．人ppGalNAcT2基因正义表达载体的构建及其对肿瘤细胞SHG44的作用采用PCR方法，从pDONR201．T2得到ppGalNAc—T2全长编码序列，亚克隆至真核表达载体pcDNA一3．1，脂质体介导基因转染人神经胶质瘤细胞SHG一44，经G418筛选后，WesternBlot和RT-PCR鉴定获得高表达的细胞株。运用RT-PCR方法检测MMP

6、s、TGF．Bl等与肿瘤细胞浸润转移及增殖等相关基因的表达变化，MTT及流式细胞仪检测细胞增殖的变化。结果显示高表达ppGalNAc．T2的细胞MMP2、MMP9及TGFpI的mRNA表达有所下调，但MMPl4和UPAR却随着ppGalNAc．T2表达的上J：t。有所上升，而细胞增殖速度加快。3．人ppGalNAcT2基因反义RNA表达载体的构建及其生物学特性的研究采用PCR方法，从pDONR201．T2扩增两段不同长度ppGalNAc—T2基因片段，亚克隆至真核表达载体pEGFP．C1中，脂质体

7、介导基因转染至人胃癌细胞株SGC7901中，经G418筛选后，通过荧光显微镜、流式细胞术检测反义重组载体的表达情况；利用RT-PCR检测转染反义重组载体后ppGalNAc．T2mRNA表达变化及MMPs、TGFl31等与肿瘤细胞浸润转移及增殖相关基因的表达变化，MTT检测细胞增殖的变化，并进行了形态学的观察，同时利用共聚焦显微镜对转染进细胞的质粒所表达的产物进行定位观察。结果表明转染反义重组载体后，下调了细胞ppGalNAc—T2mRNA的表达，同时不同程度地上调了MMP2、TGF]31的表达，但

8、MMPl4和UPAR相反，与ppGalNAc．T2成正相关。MTT实验显示转染细胞比未转染细胞的增殖速度减慢。在形态上观察到转染了反义RNA表达载体的细胞相对于未转染的细胞显得更加梭长。通过共聚焦显微镜的观察初步对该基因产物进行了定位。关键词：多肽：N一乙酰氨基半乳糖转移酶2，人神经胶质瘤细胞株SHG44，人胃癌细胞株$GC7901，RT-PCR，MMPs，TOFIBl，细胞增殖lI查!坠!!：圭竺墨兰兰塾堕堕壁堕!!￡堕!!!!!!三!垂墨兰星墨墨堡墼堡塑塑堡墨苎堕丝塑塑生堡垒塑