三七皂苷r1及pim-2在h2o2诱导的心肌细胞损伤中的作用机制研究

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1、南方医科大学2010级博士学位论文三七皂苷Rl及Pim．2在H202诱导的心肌细胞损伤中的作用机制研究StudyonprotectiveeffectandmechanismofNotoginsenosideR1andPim·2oncardiomyocyteapoptosisinH202-inducedinjury课题来源：国家自然科学基金(N—o．81072776)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院答辩委员会主席答辩委员会委员潘芸芸贾钰华中西医结合临床学术型博士中医药学院吴伟康教授赖新生教授吕志平教授刘晓伟教授文小敏教授孙学刚研究员2013年4月10日广州博士学位论文三七皂苷R

2、1及Pim一2在H202诱导的心肌细胞损伤中的作用机制研究博士研究生：潘芸芸指导老师：贾钰华摘要一、目的：近年来，国内外大量研究文献都表明氧化应激是许多病理因素造成心血管损伤的共同机制，在许多心血管疾病的病理过程中都有过量氧自由基产生，同时抗氧自由基防御机制却受到抑制，如动脉粥样硬化(AS)、高血压病、缺血性心脏病、高脂血症等。氧化应激损伤心肌细胞的转归与氧化应激的程度相关，在一定应激强度范围内，氧化应激对心肌细胞造成的损伤是可逆的，而超过一定限度，则对心肌细胞造成不可逆的损伤，主要包括心肌细胞的凋亡和坏死。原癌基因Pim(Proviralintegrationsiteofmurine)家族是

3、哺乳动物细胞中的丝／苏氨酸激酶，属于钙调蛋白依赖性的蛋白激酶，包括Pim．1、Pim．2和Pim．3。大量的实验研究已证实，Pim激酶的上调与细胞凋亡的抑制存在显著的相关性。Pim一2持续表达能够促进细胞长期抵抗各种凋亡信号的刺激。研究证实Pim．1在Akt通路中保护心肌细胞损伤，而在Pim．1缺失小鼠中Pim．2的表达增高了4．6倍；Pim．1缺失小鼠在心梗后7天，Pim．2的表达增高2．75倍。但Pim．2在心肌细胞中的表达及作用尚缺乏研究，有必要探讨Pim．2在心肌细胞损伤中的作用及机制。三七是具有多种心血管活性的中药，临床广泛应用于心血管疾病的防治。现代化学和药理学研究发现三七总皂苷(

4、Panaxnotoginsengsaponin，PNS)是三七的主要活性成分，含有多种单体皂苷主要有：人参皂苷Rbl，人参皂苷Rgl，三七皂苷R1。本课题以三七皂苷Rl为研究对象，旨在了解三七皂苷R1对心肌细胞损伤中文摘要的保护作用，并探讨其参与调节的细胞信号通路，凋亡相关蛋白，并了解其对Pim．2的调控作用。二、方法：1．乳鼠心肌细胞的原代培养外科无菌条件下取出乳鼠心脏，用胰酶40C过夜，终止消化，再用胶原酶消化液逐步消化法分离单个心肌细胞，接种至培养瓶中，采取差速贴壁分离法以去除心肌成纤维细胞，得到纯度较高的心肌细胞用于实验。2．H202致心肌细胞氧化应激模型建立心肌细胞正常培养2．3天后

5、，选取细胞密度在80％．95％以上的，自律性搏动120～140次／min的心肌细胞用于实验，选取不同浓度与时间点的H202干预心肌细胞，选择合适的浓度及干预时间用于后续实验。3．三七皂苷R1预处理心肌细胞心肌细胞培养的第2．3天，细胞生长接近80％融合时，心肌细胞预先用不同浓度三七皂苷R1培养24h，进行三七皂苷R1毒性测试，选取合适的高、中、低剂量组进行相关后续实验。4．MTT比色法测定心肌细胞活力将心肌细胞接种于九十六孔板，按实验分组给予相应的处理因素后，按MTT法具体操作步骤进行操作，在酶标仪490nm处测其OD值并计算各组心肌细胞存活率。5．流式细胞术检测心肌细胞凋亡率心肌细胞按照实验

6、分组处理后，用不含EDTA的胰酶消化收集，以AnnexinV-FITC／PropidiumIodide进行染色，室温、避光、反应5～15min，上流式细胞仪(激发波长488nm，发射波长530nm)进行检测。6．心肌细胞LDH、MDA、SOD的检测将心肌细胞接种于六孔培养板中，按不同实验目的进行分组处理，处理完毕后，分别按照LDH、MDA、SOD检测试剂盒说明书进行操作，在酶标仪420nm处测量每组OD值并计算各组细胞内LDH、MDA、SOD的含量。实验重复三次以上。7．实时定量PCR检测心肌细胞内Pim．2mRNA的表达心肌细胞按照II博士学位论文2×107／孔的浓度接种至六孔板中，取正常培

7、养2．3天后状态最佳的心肌细胞用于实验。实验分组依次为：正常对照组、H2020．5、1、2、3、6h五个时间组，50l_1,MH202干预心肌细胞。用Trizol提取心肌细胞总RNA，在紫外分光光度计上测定OD260／OD280，鉴定提取的RNA纯度和浓度。然后，反转录合成eDNA，根据GeneBank中Pim．2、GAPDH的基因序列资料，借助于计算机软件PrimerPremier5．0设计引物