ac-a和pde-i对小鼠卵泡的发育和卵母细胞成熟的影响

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1、AnhuiAgriculturalUniversityMasterDegreeThesisEffectsofAC-AandPDE-IonthefolliclesdevelopmentandmeioticresumptionofimmaturemouseoocytesPostgraduate:YangPanSupervisor:Prof.CaoHongguoCo•supervisor:AssociateProf.ZhangXiaorongCollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,230036

2、本项研究受下列基金资助国家自然基金（编号：30800784）国家863项目（编号：2011AA100307）国家转基因项目（编号：2009ZX08008-007B）SUPPORTBYNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.30800784)NationalHigh-TechR&DProgram(No.2011AA100307)NationalTransgenicBreedingProgram(No.2009ZX08008-007B)摘要卵巢中可利用的卵母细胞的数量是有限的，尤其是人的卵巢中卵母细胞的数量更是屈指可数。为了能够在体外获得大量的

3、卵母细胞，开发利用卵泡中的腔前卵泡成为重要的研究项目。以小鼠作为模式动物研究卵泡在体外发育和卵母细胞发生减数分裂的影响因素，能更好的了解卵母细胞成熟的机制，为进一步在体外获得大量卵母细胞提供参考。本实验通过添加酰胺酸环化酶激活剂(AdenosineCyclaseActivator,AC-A)，Forskolin和磷酸二酯酶抑制剂(PhosphodiesteraseInhibitor,PDE-I)，Cilostamide，它们的作用分别是促进环磷腺苷酸(CyclicAdenosine3',5'-monophosphate,cAMP)的合成和阻滞cAMP的降解，以期获得减数分裂效率高、质量

4、好的卵母细胞。实验一利用悬滴法培养16.5dpc(dayspostcoitum)的胎鼠卵巢组织，通过每2d更换一次卵巢培养基，从第6d开始能够看到卵泡的生长。大约培养14d(相当于10dpp)后机械法分裂卵巢组织，游离出大量透明带较薄的GV裸卵，部分卵泡直径约60μm左右。实验二利用悬滴法培养新生3dpp(dayspostpartum)小鼠的卵巢组织，每2d更换一次卵巢培养基，大约培养7d(相当于10dpp)后机械法分裂卵巢组织，绝大多数是80-90μm的卵泡，个别裸卵呈现出正常的透明带。实验三研究将Forskolin和Cilostamide添加至二级卵泡培养基中对卵泡在体外长期培养的

5、影响。实验组分别添加10μMForskolin和10μMCilostamide，对照组不添加。结果显示，二级卵泡在体外培养12d，不管是单独添加还是联合添加Forskolin和Cilostamide并没有改变二级卵泡存活率。在hCG和EGF的刺激下诱导类囊腔的卵泡释放粘液化的COCs，而体外成熟这些COCs仍能够排出PB1或进行孤雌激活。实验四旨在研究Forskolin和Cilostamide对卵母细胞成熟的影响，以利于筛出与卵母细胞减数分裂有关的基因。本实验通过在体外成熟培养基中单独或联合添加10μMForskolin、10μMCilostamide处理卵丘卵母细胞复合物(Cumul

6、us-oocytecomplexs,COCs)和自然裸卵(denudedoocytes,DOs)。结果显示：经过24h培养后，Forskolin和Cilostamide能够阻滞COCs的成熟，实验组的减数分裂率(23.3%，21.6%和14.3%，P﹥0.05)与对照组(98.8%)相比有明显的差异(P＜0.05)。然而，Forskolin和Cilostamide却能够提高DOs的减数分裂率，实验组与对照组之间无明显差异(27.5%，26%，24.8%VS15.4%，P﹥0.05)。对COCs实验组中那些停滞在GV期的卵母细胞，转入未添加Forskolin和Cilostamide的培养

7、基中继续培养，24h后卵母细胞的减数分裂恢复率明显高于卵巢I中自然存在的GV期裸卵。免疫荧光分析体外成熟的COCs和DOs，结果显示：处理组在减数分裂过程中，纺锤体形成和染色体排列都与对照组一致。说明了Forskolin和Cilostamide不影响卵母细胞减数分裂核区的结构。对COCs实验组中那些停滞在GV期的卵母细胞提取mRNA与自然裸卵相比较，结果表明由Forskolin和Cilostamide处理后的COCs其减数分裂恢复相关的基因GD