耐辐射异常球菌过氧化物酶osmc与ohr的功能研究

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1、CIassifjedIndex：U．D．C：SouthwestUniversityofScienceandTechnoIogyMasterDegreeThesiSF‘‘onaIanaIYiofperox—OsmCandOhrunctionaIanaYSSotroxIdaseOsmCandr‘int．DeinococcusradioduransR1Grade：2011．Candidate：GuangyanCuiAcademicDegreeAppIiedfor：MasterSpeciaIity：BotanySupercisor：Prof．JinWangMarch30，

2、20140UllU11111UlIUlY2586139独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。签名：柑也日期：J-‘i'f．‘．s关于论文使用和授权的说明本人完全了解西南科技大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文的复印件，允许该论文被查阅和借阅；学校可以公布该论文

3、的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。(保密的学位论文在解密后应遵守此规定)签名：桎胞导师签名：元乃彩日期桫∥．多。j／西南科技大学硕士研究生学位论文第1页摘要过氧化物酶(Peroxiredoxin，简写为Prx)是一种普遍存在于生物体中用于清除过氧化物的物质。细菌等微生物中的Prx可以分成两类：含两个半胱氨酸的过氧化物酶(2-CysPrx)和只含一个半胱氨酸的过氧化物酶(1-CysPrx)。耐辐射异常球菌是一种具有超强电离辐射抗性的微生物，且对氧化、干旱和高盐胁迫也具有极强的耐受力。异常球菌基因组中的DR1538和DR1857两个基因分别编

4、码了OsmC和Ohr蛋白，这两个蛋白均属于2-CysPrx。我们主要通过构建基因缺失突变株、胁迫表型鉴定、转录水平表达分析、蛋白纯化和体外酶活测定等方法来研究OsmC和Ohr蛋白的功能。实验结果如下：通过对osmC和ohr两个基因进行生物信息学分析，结果表明：osmC基因全长441bp，编码146个氨基酸残基(aa)，蛋白质的分子量大小约为15．7kDa；ohr基因长420bp，编码139aa，蛋白质的分子量为14．5kDa；氨基酸结构域分析结果表明OsmC和Olaf同属于OsmC超家族；多序列氨基酸的同源比对结果表明，OsmC与Ohr亚家族蛋白之间只有约20％的

5、同源性，两个亚家族各自的同源性为40％．60％，；OsmC和Ohr蛋白的二级结构都主要是由旺．螺旋及不规则卷曲组成的，两个蛋白都为亲水性蛋白；并运用同源建模方法对未知结构蛋白OsmC进行了三维结构预测。·通过体外三段融合PCR技术和线性转化方法构建了耐辐射异常球菌AosmC与Aohr突变株。从野生型菌株、AosmC与Aohr突变株在正常条件下的生长情况可以看出三株菌的生长差异并不显著，表明osmC基因与ohr基因并不影响耐辐射异常球菌菌株的生长；野生型菌株、AosmC和Aohl·突变株在几种不同胁迫冲击(H202、CHP、山梨醇、NaCl和乙醇)下的表型鉴定结果表

6、明AosmC突变株对H202胁迫冲击极端的敏感，对过氧化异丙苯(CHP)冲击并不敏感，而Aohr突变株对CHP的冲击敏感，对H202的冲击并不敏感，而三个菌株在其他胁迫(山梨醇、NaCl、乙醇)冲击下的表型差异并不明显。在上述几种胁迫冲击条件下，野生型菌株中的osmC基因与ohr基因的的相对表达量测定结果表明，osmC基因受到了H202的显著诱导，与未处理菌株相比，表达量上升了约8．9倍，而osmC基因在其他胁迫下的相对表达量上升不明显：ohr基因在几种胁迫(H202、CHP、NaCl)冲击下的相对表达量都上升了约2倍。西南科技大学硕士研究生学位论文第

7、I页通过构

8、建pET28a-osmC、pTWINl．ohr重组表达菌株，我们获得了纯化的OsmC蛋白与Ohr蛋白，并对两者在体外的底物降解速率进行了测定，结果表明OsmC和Ohr蛋白都能降解H202与CHP，其中OsmC蛋白降解H202的速率要大于降解CHP的速率，与之相反的是，Ohr蛋白降解CI-IP的速率要大于降解H202的速率。以上实验结果表明OsmC蛋白与Ohr蛋白在体外选择底物的偏好性并不一致，OsmC偏好选择H202，Ohr偏好有机过氧化物。而它们在体内的底物选择和具体活性位点还需要进一步研究。关键词：耐辐射异常球菌；过氧化物氧化还原酶；OsmC与Ohr；非生物胁

9、迫；酶活测