huvec分离、培养、鉴定及深低温冻存对其凋亡地试验研究

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1、温州仄学院颂．I：学位论文HUVEC分离、培养、鉴定及深低温冻存对其凋亡的实验研究中文摘要目的：1．完善一套人脐静脉血管内皮细胞消化、分离、原代培养和鉴定方法；以及应用脐静脉内皮细胞模拟组织工程血管再内皮化过程，证实该细胞是否可作为理想的种子细胞构建组织工程血管。2．通过探讨深低温冻存对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)损伤机制，为如何提高脐静脉内皮细胞库中活细胞活力和数量指出具体步骤，提高构建理想组织工程血管的成功率。方法：1．利用0．1％胶原酶消化、分离脐静脉血管内皮细胞，体外原代培养。0．25％胰酶和0．02％EDTA消化液消化传代。根据人脐静脉血管内皮细胞特有的生物学特征进行细胞化学染

2、色及细胞对乙酰化LDL高摄取试验，对该细胞鉴定。2．以1X101／ml浓度的ImlHUVEC液置于基质胶上，观察组织工程血管内皮化过程。3．应用程序降温冻存脐静脉内皮细胞，对新鲜组、冻存24h、冻存1w、冻存2w、冻存4w和冻存8w组细胞台盼兰染色检测各组细胞存活率。4．绘制出冻存前后各组细胞的生长曲线，研究深低温冻存对该细胞生长增殖能力的影响。5．对新鲜HUVEC以及深低温冻存后不同时间复苏组细胞分别进行瑞氏染色，进行深低温冻存后细胞形态学研究。6．Annexin-V对深低温冻存前后各组脐静脉内皮细胞染色，流式细胞仪检测，’观察不同冻存时间对其凋亡影响。7．对深低温冻存前后Caspase一3

3、活性检测，判断不同深低温冻存时间对该酶的影响。结果：1．体外原代培养的人脐静脉血管内皮细胞生长状态良好，呈典型的铺路石样形态学表现，细胞免疫组化显示Ⅷ因子、CD31、CD34均呈阳性反应，Dil—Ac—LDL摄取荧光检测提示其具有强摄取能力，具有典型血管内皮细胞生物学特征。2．观察到基质胶中脐静脉血管内皮细胞可在基质胶小孔上贴壁生长，48d,时后可以融合成单层，随时间延长该细胞层逐渐增厚。用该细胞成功模拟了组织工程血管再内皮化过程。3．台盼蓝染色结果表明冻存前后各组细胞存活率分别为97．20±0．21％、85．62±0．43％、83．58±O．86％、80一91±0．64％、78．45±0．1

4、9％、76．3l±0．36％，溢州医学院顾I二学位论文各组比较有统计学意义。4．绘制新鲜组、冻存24h、冻存1w、冻存2w、冻存4w和冻存8w六组生长曲线，发现细胞生长曲线形态相似，但细胞对数生长速率随冻存时间延长有减慢趋势。5．观察新鲜组和深低温冻存各组细胞瑞氏染色结果，除新鲜组外在冻存组均发现有细胞凋亡，且随冻存时间越长而凋亡细胞数目逐渐增多。6．Annexin-V染色检测六组HUVEC，新鲜组、冻存24h、冻存1w、冻存2w、冻存4w和冻存8w细胞凋亡率分别为3．20±O．65％、8．06±1．22％、舶．33±1．9l％、12．90±1．39％、16．91±0．73％、20．30±1．

5、30％，各组比较均有统计学意义，深低温冻存时间越长，其细胞凋亡程度也就越重．7．流式检测六组凋亡蛋白酶Caspase-3活性，新鲜组、冻存24h、冻存1w、冻存2w、冻存4w和冻存8w凋亡蛋白3一M1活力分别为17．44±1．54、41、77±2．4l、49．87±2．28、51．62±2．48、58．29±5．oo、60．04±9．25，冻存后凋亡蛋白3活力显著增加，与冻存时间呈依赖性关系。结论：1．本研究完善了一套人脐静脉血管内皮细胞原代分离、培养、及鉴定方法；应用该细胞成功模拟组织工程血管再内皮化过程，证实该细胞可作为构建组织工程血管的理想的种子细胞。2．本研究发现深低温冻存减弱脐静脉血

6、管内皮细胞生长增殖能力，深低温冻存启动了脐静脉内皮细胞诱导系统，诱导了细胞凋亡，并且随冻存时间增加而凋亡程度也就越高，对于建立脐静脉内皮细胞库有非常重要的意义，为构建理想的组织工程血管提供的理论基础。关键词：人脐静脉血管内皮细胞深低温冻存复苏组织工程血管凋亡4温州医学院顾Ij学位论义TheIsolation、CultureandIdentificationofHUVECandtheEffectsofCryopreservationforitonApoptosis．AbstractObjective：1．Toperfectasetofdigestion，isolation，primarycult

7、ure，identificationofhumanumbilicalveinendothelialcellsandsimulatetheendothelialprocessofvasculartissue芦ngineering2．Toexploretheeffectsofcryopreservationonapoptosisforhumanumbilicalveinendothelialcells