番茄ago基因的分离鉴定及slmir168、ago1在番茄生长发育过程中的功能研究

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1、番茄AGO基因的分离鉴定及SlmiR168、AGO1在番茄生长发育过程中的功能研究重庆大学博士学位论文学生姓名：先志强指导教师：李正国教授专业：生物学学科门类：理学重庆大学生命科学学院二O一四年十月万方数据万方数据IsolationandCharacterisationofSlAGOGenesandStudyonBiologicalFunctionofmir168andAGO1inTomatoAThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheDoctor’sDeg

2、reeofBiologyByXianZhiqiangSupervisedbyProf.LiZhengguoSpecialty:BiologySchoolofLifeSciences,ChongqingUniversity,Chongqing,ChinaOctober,2014万方数据万方数据中文摘要摘要转录后调控是植物中一类重要的调控方式，在植物发育的各个阶段以及病毒防御中都发挥着重要的调控作用。miRNA是植物中内源的一类参与到转录后调控中的重要小分子，参与植物叶形态的形成、营养生长向生殖生长的转变以及配子的形成等生命活动。研究表明，miRNA是植物中普遍存在的一种调

3、控手段，但是目前对于miRNA在植物生命活动中的研究尚不够深入。AGO蛋白是在miRNA起作用的沉默复合体中的核心组成部分，其可以结合miRNA并在miRNA指导下对靶标基因的表达进行调控。关于重要的果实模式生物——番茄中AGO基因的分布、表达以功能目前尚不明确；另外，AGO家族中的AGO1受miR168调控，但其调控机制及对番茄的生理作用未见报道。因此，本研究根据拟南芥的AGO基因与番茄基因库进行对比分析，在番茄基因组中找到15个潜在AGO基因，系统发育分析发现其可根据其相似性分为三个亚家族：与拟南芥AGO1近似的AGO1亚家族、与拟南芥AGO2近似的AGO2亚家族及

4、与拟南芥AGO4近似的AGO4亚家族；对其进行组织特异性检测发现，大多数SlAGO基因在番茄的根、茎、叶、花以及花蕾、雄蕊、雌蕊等被检测组织中为组成型表达，但是SlAGO5只在生殖系统里表达，而SlAGO4D与SlAGO7在果实发育前期表达明显强于其它组织与时期；细胞定位分析结果表明，番茄AGO蛋白定位于细胞核与细胞质中，但在AGO1A、AGO1B、AGO5和AGO10的细胞定位观察中发现细胞核膜及细胞质膜上存在大量荧光信号。在前期生物信息学分析的基础上，获得番茄miR168序列及其靶标基因SlAGO1A及SlAGO1B的信息，然后借助超表达35S驱动的miR168以获

5、得miR168功能获得的转基因植株；采用在SlAGO1A与SlAGO1B与miR168匹配位点定点突变（4m-SlAGO1A及4m-SlAGO1B）的方法来获得miR168-resistance转基因植株；采用miR168-sponge的方法获得miR168功能缺失的转基因植株。通过对这三种转基因植株表型的观察及分析表明：1)在番茄中分离的15个AGO基因中，SlAGO1A及SlAGO1B两个AGO基因受miR168调控，SlAGO1A及SlAGO1B蛋白又可促进miR168的表达和稳定，miR168与SlAGO1A与SlAGO1B之间存在相互调控而到达平衡的关系；2)

6、在对三种转基因的表型的观察中发现，miR168可以通过影响SlAGO1s而参与到植物的生长、发育阶段的转化、成熟叶片的向上反应、果实生成、果实膨胀等过程中。通过分子检测，明确miR168可以通过SlAGO1s而影响早期在营养生长及转化过程中起重要作用的miR156的累积，进而影响植株的生长速率及开I万方数据重庆大学博士学位论文花时间；miR168可以通过调控SlAGO1s而影响直接参与到乙烯通路中的miR164及潜在参与到乙烯相应中的miR172的累积而造成叶片向上反应；miR168可以通过调控SlAGO1s而影响参与生长素途径中的miR167及miR393，并且影响潜

7、在参与赤霉素途径中的miR171而影响果实的生成及膨大；3)在三种转基因对激素及环境的相应过程中，发现miR168可以通过降低SlAGO1s的表达方式来影响种子在不同浓度ABA处理下的发芽速度以及发芽率。另外，miR168是随光周期呈现节律性震荡并且超表达miR168的转基因植株在10µMNPA的处理下，其茎的延伸能力明显优于野生型，结合超表达miR168植株变高及花枝变多的表型，能接受光信号的miR168可以通过影响SlAGO1s的表达，从而影响转基因植株对生长素的相应，进而平衡花絮的发育，使得转基因具有更多的花；4)对miR168及S