寻常型天疱疮抗原dsg3基因真核表达及在临床检测中应用

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1、中国医科大学硕士学位论文寻常型天疱疮抗原Dsg3基因的真核表达及在临床检测中的应用姓名：徐媛媛申请学位级别：硕士专业：皮肤病与性病学指导教师：耿龙20070301中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：毖缝日期：五=Z芝

2、：纽中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印，缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：毖缓指导教师签名：!．苎丝日期：矗五：主：．；口·中文论著摘要·寻常型天疱疮抗原Ds93基因的真核表达及在临床检测中的应用刖昌寻

3、常型天疱疮(Pemphigusvulgaris，PV)是一种慢性、复发性的大疱性皮肤病，以皮肤和粘膜出现水疱、大疱为特征。PV患者体内的自体反应性IgG与角质形成细胞表面结合，破坏了细胞间连接结构，导致细胞间连接的缺失，形成表皮内水疱。PV患者自身抗体的靶分子被证实是桥粒结构的一种成分一跨膜桥粒核心糖蛋白3(desmoglein，Ds93)，属于钙粘蛋白超家族的成员。从Dsg的氨基酸序列推论显示，它和钙依赖细胞黏附分子有同源性，而桥粒的跨膜糖蛋白Dsgl，也是落叶型天疱疮的自身抗原。和典型的钙粘素一样，PV抗原有5个大约相似的细胞外的结构域，称为ECl(氨基端卜-EC5(羧基端)。通

4、过X射线衍射晶体分析法显示钙粘蛋白的氨基末端的三维结构有一个重要的二聚体结构，称为二聚体链。虽然有很多粘连抑制性抗体被发现与ECl结合，但是很多粘连抑制性抗体和刺激性抗体也和其他的胞外段结合，包括EC5和EC3。另外，在一些人的组织中也发现有上皮细胞钙粘蛋白的EC2和EC3的自然突变的发生，在细胞外功能区的上皮细胞钙粘蛋白的钙离子结合部位的突变可以造成粘着功能的丧失。另外，用生理物理学直接测量钙粘蛋白外功能区分子力的研究还发现复杂的粘着物相互作用的证据，当外功能区完全重合时，粘着力最大。虽然没有研究证实特异性结合位点，仍然认为5个细胞外功能区在上皮细胞钙粘蛋白相互作用中起重要的作用。

5、有人已经用杆状病毒表达系统获得人Ds妒重组蛋白质，包括Ds酪的整个细胞外功能区域，并已经过人PV患者血清的天然抗体证实。但是，哺乳动物表达系统在蛋白质加工方面比杆状病毒表达系统更高级，哺乳动物表达系统中的重组蛋白与其天然结构更加一致。这个研究中，应用哺乳动物表达系统，我们获得Ds93整个编码区的重组体蛋白。我们关注PV患者血清和重组蛋白Ds93的免疫反应性，并且被一组PV患者的血清证实。另外，我们想用重组的Ds驴细胞外功能区作为抗原，并用特殊的ELISA方法检测与这些抗原发生反应的抗体，可用于PV的临床检测。材料和方法一、病例和主要试剂1、PV患者组：PV患者40人均来自辽宁省内，其

6、中男22名，女18名，年龄14～60岁，平均38岁4"14岁，为中国医科大学附属第一医院皮肤科住院患者。所有病例均经临床、组织病理及免疫病理证实。正常对照组；本院健康献血者40名。2、质粒、菌株及细胞：真核质粒peDNA3．1rM／myc．His(．)B由北京军事医学科学院张兆山教授惠赠。菌株TGI、人宫颈癌细胞系Hela细胞由中国医科大学病原微生物教研室提供。3、主要试剂：Ni-NTApurificationsystem、脂质体转染试剂盒脂质LipofectamineTM2000和G418(Geneticin)为美国Invitrogen公司产品，QIAprepSpinMinipre

7、pKit(提质粒试剂盒)为QiageIl公司产品，购自基因公司，胰蛋白酶(Trypsin)、RPMll640培养基为美国Hyclone公司产品，限制性内切酶、碱性磷酸酶及T4DNA连接酶、RNAeasyMinikit、PlasmidpurificationMiniprepkit试剂盒等分别购自Takara生物工程公司及Promega公司。4、主要仪器：二氧化碳培养箱；超净工作台；低温超速离心机；紫外分光光度计；自动凝胶电泳成像系统；通用电泳仪：．80"0深