食品中三种致病菌多重pcr检测体系的建立及初步应用

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1、河北农业大学硕士学位论文食品中三种致病菌多重PCR检测体系的建立及初步应用姓名：张政申请学位级别：硕士专业：农产品加工及贮藏工程指导教师：张伟20120520摘要近年来，全球食品安全恶性事件频发，食品安全问题是影响公共健康的重要因素，已经成为社会关注的热点。其中，细菌性食物中毒是导致各种食品安全恶性事件的主要原因。因此，食源性致病微生物的检测是食品卫生安全检测中一个重要的部分。目前，食源性致病微生物主要采用分离、培养然后生化鉴定的方法，操作繁琐，检测时间较长，通常需要3．5d才能完成，且每次只能检出一种致病菌，灵敏度较低。因此，建立快速、高效、准确的食源性致病菌检测方法迫在眉睫。近年来，

2、PCR技术发展十分迅速。多重PCR技术可以实现在一个反应管中同时对多种致病微生物的检测，具有高效、低成本、高灵敏度等优点。因此，本研究建立了食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和蜡样芽胞杆菌的多重PCR检测技术。本文根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nut)、沙门氏菌的侵染上皮细胞表面蛋白基因(invA)和蜡样芽胞杆菌的溶血素基因(hblA)设计了3对特异性引物，进行多重PCR反应，可实现对三种致病菌的同时检测。试验过程中对反应体系中退火温度、M92+、dNTPMixture、Taq酶和反应循环数等影响因素进行优化，确定了最适多重PCR反应体系和循环参数。该反应体系为：2．5gL10×PCR

3、buffer，2．0gLMgS04，2．0gLdNTPMixture，上游引物各1止，下游引物各1gL，O．5gLTaq酶(5u)，三种致病菌DNA模板各2．0止，加ddH20至25止。循环参数：采用冷启动，940c预变性5min；940C变性40S，590c退火40S，720C延伸40S，30个循环；720C终延伸10min。在此条件下，检测了22株菌，4株金黄色葡萄球菌、4株沙门氏菌和4株蜡样芽胞杆菌均为阳性结果，而其它10株菌均为阴性结果。将三种致病菌随机组合，均能被检出。将多重PCR扩增产物胶回收进行核苷酸测序，将测序结果网上BLAST，证实扩增产物与已知序列的同源性均达到99％

4、，因而该多重PCR反应特异性强。本研究用该方法直接检测纯菌液，普通热裂解法提取DNA模板，金黄色葡萄球菌的灵敏度为103CFU／mL，沙门氏菌的灵敏度为104CFU／mL，蜡样芽胞杆菌的灵敏度为103CFU／mL；同时检出三种致病菌的灵敏度达到104CFU／mL。本研究采用五种不同方法从样品中提取三种致病菌DNA模板进行多重PCR反应，比较DNA模板提取方法的优劣。结果显示，采用溶剂提取热裂解法提取DNA模板效果好，操作较简便，且价格较低廉。该多重PCR反应检测人工污染纯牛奶，采用溶剂提取热裂解法提取DNA模板，金黄色葡萄球菌检出限为102CFU／mL，沙门氏菌检出限为104CFU／mL

5、，蜡样芽胞杆菌检出限为102CFU／mL，同时检出三种致病菌的检出限达到104CFU／mL。对市场上购买的50份样品进行检测，并与国标方法对比，多重PCR方法检测样品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和蜡样芽胞杆菌的敏感性均为100％；特异性：金黄色葡萄球菌93．5％、沙门氏菌94．7％、蜡样芽胞杆菌90．6％；符合率分别为96％、92％、94％。本研究成功建立了多重PCR法检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和蜡样芽胞杆菌的反应体系。该方法具有特异性强、灵敏度高、检出限低、检测速度快和操作简便等优点。该法初步应用于实际样品的检测，整个过程在6h以内即可完成。因此，该多重PCR检测方法具有一定的实

6、际推广价值，对及时检出食源性致病菌，减少食源性致病菌引起的食物中毒，保障我国国民饮食安全具有重要的意义。关键词：多重PCR；检测；金黄色葡萄球菌；沙门氏菌；蜡样芽胞杆菌EstablishmentandApplicationofMultiplexPCRforDetectionofThreeFood·borneBacterialPathogensName：2laangZhengMajor：．ProcessingandstorageofagricultureproductionSupervisor：．ProfessorZhangWeiAbstractInrecentyears，globalfo

7、odsafetyincidentsareinhigh丘equencyandbecomeavitalfactoraffectingpublichealth．Intheseproblems，thefoodpoisoningresultofbacterialpathogenswasthemostharmful．Thus，foodpathogenicbacteriasdetectionisanimportantaspectinfoodhyg