核糖体蛋白s29功能研究

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1、分类号：密级：单位代码：10312学号：20112014南京医科犬掌博士学位论文研究生：指导教师：学科专业：学院名称：完成时间：于婧朱昌亮病原生物学南京医科大学基础医学院二O一四年四月南京医科大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除了文中特另JJJu以标注引用的内容外，本论文不包含任何其它个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：备曦日期：刀l乒年6月p日新签澎石学位

2、论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于(请在以下相应方框内打“√”)：1、保密口，在一年解密后适用本授权书。2、不保密d作者签名：身嘎日期：州年5月M翮咄≤日期仰代年川。日目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·5第一部分核糖体蛋白$29(RPS29)参与蚊抗药性机制研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·8前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·8材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··ll一、材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11二、方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13(一)蚊成虫以及蚊细胞总RNA的提取与鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯--13(二)TAP实验筛选RP29相互作用蛋白质⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯-14(三)GST-pul

4、ldown实验验证RP29与CYP6N3相互作用⋯⋯⋯⋯24(四)免疫荧光实验验证RP29与CYP6N3相互作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯·30(五)高表达RPS29及CYP6N3对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响⋯33(六)低表达RPS29及CYP6N3对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响⋯35(七)Westemblot实验检测GFP．RPS29与CYP6N3-Myc蛋白表达36(八)统计分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·37结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·‘38一、TAP筛选RPS29相互作用蛋白质⋯⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯--38二、CYP6N3结构分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39三、GST-pulldown实验验证RPS29与CYP6N3相互作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯-40四、免疫荧光结合激光共聚焦显微镜验证RPS29与CYP6N3相互作用··41五、RPS29与CYP6N3相互作用对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响⋯⋯⋯42六、RPS29与CYP6N3相互作用机制研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·-45讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·二⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一49第二部分核糖体蛋白$29(RPS29)参与核糖体蛋白转录调控机制

6、研究⋯··56前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··56材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··59一、材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯59二、方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯59(--)Westernblot实验鉴定siRPS29干涉效率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯59(二)芯片检测低表达RPS29对其它核糖体蛋白mRNA表达水平的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．6l(--)双荧光报告系统检测MSMs功能⋯⋯⋯⋯⋯

7、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62(四)低表达RPS29对MSMs功能的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．63(五)EMSA实验检测RPS29与MSMs相互作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．64结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．66一、芯片检测低表达RPS29对其它核糖体蛋白rnRNA表达水平的影响．66二、芯片结果分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯74三、实时定量PCR检测低表达核糖体蛋白$27(RPS27)对其它核糖体蛋白mRNA表达水平的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．76四、MSMs功能鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

8、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯78五、低表达RPS29对MSMs功能的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．79六、EMSA实验检测RPS29与MSMs相互作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．8l讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯