亚洲玉米螟几丁质酶的晶体结构与抑制剂设计

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1、万方数据博士学位论文亚洲玉米螟几丁质酶的晶体结构与抑制剂设计CrystalstructureandinhibitordesignofachitinasefromtheinsectOstriniofurnacalis学11018004大连理工大学DalianUniversityofTechnology万方数据大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的

2、研究成果，也不包含其他己申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文题目：垩测垂苤蝗且工厦酶的晶笠结掏量控制剂遮让作者签名：斗峙瑟一日期．迎年卑月卫日大连理工大学学位论文版权使用授权书本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间论文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅。学校有权保留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将本学位论文的全部

3、或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。作者签名：牢缸盈日期：趋!生年—L月j羔日导师签名：聋本吼逝生年阜月且日答辩委员会主席：匕型丛日期：a鱼f生年j『_月』上日万方数据大连理工大学博士学位论文摘要ⅢPIIINIJMIINIIIIIIJIIllIY2728854糖基水解酶18家族(GHl8)几丁质酶(chitinase，EC3．2．1．14)随机催化水解几丁质(chitin)和壳糊精(chitodextrins)的B．1，4糖苷键。该酶广泛分

4、布于细菌、真菌、昆虫、植物和哺乳动物等生物体内，在营养、病原菌入侵、节肢动物蜕皮、免疫和防御等生理过程中发挥着重要作用。解析并获得GHl8几丁质酶的结构和功能的关系对于疾病控制、植物保护和药物设计均具有重要意义。与其他物种相比，昆虫是GHl8几丁质酶含量最丰富的生物体，包含8个分支。其中groupI几丁质酶负责昆虫蜕皮时旧表皮的几丁质降解，对于昆虫的生长发育至关重要。目前尚无昆虫几丁质酶结构与功能的报导。本论文以农业害虫亚洲玉米螟的groupI几丁质酶Oj圮htI为研究对象，主要获得以下结论：1

5、)Ofl2htI具有独特的结构特征重组表达的全长OjChtI不稳定，我们因此重组表达并结晶催化域(叩M．CAD)，并解析得到分辨率为1．7A的Ofl2htI．CAD晶体结构(PDB登录号3w4r)。晶体结构分析表明Oj(：htI．CAD包含核心域和几丁质插入域。核心域为典型的(fl／a)8折叠桶结构，催化残基指纹序列144DxDxEl48位于p4和a4之间的loop上，而几丁质插入域形成活性裂缝的一面墙。Ofl2htI．CAD拥有长且两端开放的底物结合裂缝，依次排列9个可能结合底物糖基的芳香族氨

6、基酸残基。其不同于所有已知结构的几丁质酶的特征是：在底物结合裂缝的末端，有四个芳香族氨基酸(Phel59、Phel94、Trp240和Tyr290)形成一个疏水平面。单点突变体F159A、F194A、W241A、Y290A、双突变体F194A／W241A、F159AⅣ290A和四点突变体F159斛194刖W241AⅣ290A结合几丁质的能力均较野生型Ofl2htI．CAD低。其中四点突变结合能力最低，仅为野生型的40％。说明这个独特的疏水平面的生理功能与Ofl3htI．CAD的几丁质结合能力正相

7、关。2)Ofl3htI具有随机水解几丁寡糖的内切活性为了研究OJChtI．CAD水解底物的特性，我们首先利用热力学方法分析了几丁寡糖在Ofl2htI．CAD活性裂缝中的结合情况。实验结果表明几丁寡糖(GlcNAc)3-6与Ofl3htI．CAD结合的焓变、熵变均小于零，且J—rzxs／>lA矧，表明结合均为熵驱动(焓变也产生一部分贡献)，说明结合主要伴随着蛋白与底物的构像变化和水分子的排出。从(GlcNAc)3至lJ(GlcNAc)6，每增加一个糖单元，自由能降低1．0kcaltool-1，表明

8、Ofl3htI催化域包含至少6个糖基结合位点。万方数据亚洲玉米螟几丁质酶的晶体结构与抑制剂设计为了分析OJCht!．CAD的催化特性，我们利用浸泡法，将Ofl：；htI．CAD的晶体与几丁寡糖(GlcNAc)6共孵育获得分辨率为1．77A的复合物晶体结构(PDB登录号3w11)。OfChtI．CAD的结构在结合配基前后具有很好的重叠性，说明几丁寡糖的进入没有改变酶的活性裂缝以及整体结构。复合物结构中存在两个糖分子：其一为(GlcNAe)3，占据活性裂缝的一1、-2和一3位点；另一个为(GleNA