几种重要海水养殖鱼类细胞系的建立、鉴定及其应用

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1、摘要鱼类细胞培养的研究始于20世纪60年代，由Wolf和Quimby建立了世界上第一个鱼类细胞系，即虹鳟鱼生殖腺细胞系RTG22，此后，鱼类的细胞培养研究进展十分迅速。目前，鱼类细胞培养技术己成为一种重要的研究手段，广泛应用于病毒学、环境毒理学、细胞生物学、肿瘤学、基因组学、遗传学以及资源保护等方面。鱼类培养细胞作为实验对象，有着活体鱼无法比拟的优点：(1)材料容易获得，成本低；(2)重复性好，实验条件可以精确控制。因此，对鱼类细胞系进行深入研究，无论在理论研究方面，还是在实际应用方面，都具有深远意义。本研究探索了日本牙鲆(Paralichthysolivaceus)、大菱鲆(Scopht

2、halmusmaximus)、漠斑牙鲆(Pleuronectiformes)胚胎细胞分离、培养条件，建立了鱼类胚胎细胞培养技术。建立了日本牙鲆胚胎细胞系(FEC)、大菱鲆胚胎细胞系(TEC)和漠斑牙鲆胚胎细胞系(SFEC)，并用酶消化法建立了半滑舌鳎(CFnoglossu5。，Ⅳ。。)肝脏细胞系(HTLC)。日本牙鲆胚胎细胞系已传至100多代，大菱鲆胚胎细胞系传至100多代，漠斑牙鲆胚胎细胞系传至80多代，半滑舌鳎肝脏细胞系传至30多代。胚胎细胞系完全培养基采用添加抗生素、胎牛血清(FBS)、花鲈血清(SPS)、成纤维生长因子(bFGF)的DMEM，半滑舌鳎肝脏细胞系完全培养基添加了抗生素

3、、胎牛血清(FBS)、花鲈血清(SPS)、成纤维生长因子(bFGF)的MEM。胚胎细胞形态小而呈多边形、多角形、圆形，半滑舌鳎肝脏细胞系呈纤维状。本实验检测了FBS、bFGF、温度对细胞生长的影响。在一定范围内，细胞生长速度随FBS浓度的增高而加快，FBS浓度过高或过低都抑制细胞的增殖。bFGF对FEC、TEC、SFEC、HTLC细胞生长均具有强烈的刺激作用，细胞的分裂速度在含bFGF的培养基中比在缺失bFGF的培养基中要快的多。在24～30℃之间细胞生长良好，当温度高于30℃或低于12℃时，细胞生长速度降低。FEC的二倍体核型为2n=48t，TEC的二倍体核型为2n=4m+12st+28

4、t，SFEC的二倍体核型为2n=6st+42t，HTLC的二倍体核型为2n=42t，半滑舌鳎雌鱼中期分裂相具有异型染色体(zw)，雄鱼中期分裂相具有同型染色体(zz)。将GFP报告基因通过脂质体(genejammer)介导的方法转入SFEC和HTLC中并成功地获得了表达，转化率为20％左右。用牙鲆淋巴囊肿病毒(LCV)和大菱鲆虹彩病毒(TRBV)感染FEC，观察到了细胞病变效应(CPE)，在细胞内发现了大量病毒颗粒。用鳗弧菌处理TEC，检测了不同时间抗菌肽基因(Hepcidin)表达的变化。用HTLC制备染色体，通过荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridizatio

5、n，FISH)技术定位了半滑舌鳎性别特异片段，在雌鱼w染色体上获得了特异杂交信号。总之，本文建立了鱼类胚胎细胞分离培养技术，在世界上首次建立了牙鲆胚胎细胞系，大菱鲆胚胎细胞系和漠斑牙鲆胚胎细胞系，同时，用传统方法建立了半滑舌鳎肝脏细胞系。在细胞系应用方面做了一些探索，为进一步利用细胞系进行基础理论和实验研究奠定了基础。关键词：胚胎细胞系核型荧光原位杂交GFP报告基因TheEstablishment，IdentificationandApplicationofCellLinesfromSeveralImportantMarineFishAbstractresearchoffishcellcu

6、lturehasdevelopedrapidlysince1960swhenWolfandQuimbyestablishedthefirstfishcellline．RTG22intheworld．Atthepresenttime，fishcellculturinghasbecomeanessentialresearchtechnologywhichhasbeenusedextensively,rangedfromvirology,environmentaltoxicology,cytobiology,oncology,genomics，geneticsandenvironmentalpr

7、otection．Culturedfishcellshavemoreadvantagesthanlivefishastheexperimentalmaterial：I．thematerialsarecheapandeasytoobtain；2．theexperimentalconditioncouldbecontrolledaccuratelyandtheexperimentcouldberepeated．Inthepr