培美曲塞联合放疗对肺损伤的实验分析

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1、材料与方法1．2实验方法与步骤I．2．i动物饲养Wistar大鼠饲养于青岛大学附属医院清洁级动物实验室，环境温度为24±1℃，湿度为40％一70％，正常光照，根据大鼠具有随时觅食的习惯，保证饲料与水的充足供应，不锈钢鼠笼，每笼5只。1．2．2动物分组将大鼠随机分为A组(正常对照组)：10只，给予假照和等量生理盐水腹腔注射；B组；(单纯照射组)：12Gy单次照射；C组(单纯药物组)：10只，培美曲塞按20mg／kg腹腔注射10只；D组(药物照射同步组)：10只，同日行培美曲塞(20mg／kg)腹腔注射和单次照射(

2、12Gy)。1．2．3动物模型制作及照射方法各组大鼠以409／L的水合氯醛(350mg／kg)腹腔注射麻醉，用细绳固定于自制的大鼠固定器上，在x线模拟机下模拟定位，确定照射野范围：剑突上2cm至5cm，用黑色记号笔在体表做好标记，每只大鼠的射野面积约3cm×5cm。用剂量率为300cGy／min的6MV—i线照射，源皮距设为lOOcm，深度为1．5cm(大鼠胸部加0．5cm组织补偿物)。药物组大鼠予培美曲塞20mg／kg腹腔注射。药物照射同步组大鼠于实验第1日予培美曲塞联合照射，正常对照组给予假照及等量生理盐水

3、腹腔注射。1．2．4血清的采集实验前1天、实验后第7、21、35和49天，随机取各组大鼠2只，409／L的水合氯醛(350mg／kg)腹腔注射麻醉后称重并记录，采取颈椎脱臼的方法处死大鼠。用毛细采血管取大鼠内眦静脉血iml于干净的EP管中，室温凝固30min，1500r／min木15min离心，收集血清，分装后-70。C冷冻保存。1．2．5肺组织H&E切片的制作(1)取材、固定：将大鼠处死、采血后，解剖胸腔，完整分离双侧肺脏、称重、生理盐水冲洗，切取0．5cm的肺尖组织，用10％中性福尔马林溶液固定24-48小

4、时。(2)组织切片的制备：将已固定好的肺组织用生物组织自动脱水机和自动包埋机制作合适的石蜡标本。使用切片机对包埋组织近中央处切面连续切片，切片厚度为5um，青岛大学硕士学位论文置于载玻片上，60℃烤箱烤干、熔蜡、固定后备用。(3)HE染色：切片经苏木紫一伊红(H．E．)染色后，在200倍光镜下观察肺组织学改变。1．2．6血清转化生长因子B1的检测由武汉博士德公司提供的大鼠转化生长因子131ELISA试剂盒是采用典型的夹心法酶联免疫吸附的原理来检测，其步骤如下：(1)准备：血清测定前置4。C恒温复融lh，按照样品

5、：A液：B液=2：1：1的比例活化血清，按照9：1的比例加入样品稀释液，同理制备大鼠TGF—B1标准品、抗体工作液、亲和素一过氧化物酶复合物(ABC)工作液；(2)加标准品和待测样品：取足够数量的酶标包被板，分别设置标准品孔、待测样品孔和零孔，各加入0．1ul，零孔只加样品稀释液，并增加l孔作为TMB空白显色孔，置37。C恒温箱温育90分钟，甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下，不洗；(3)加抗体工作液：除零孔外，每孔加入0．1ml的生物素抗大鼠TGF一131抗体工作液，37℃反应60分钟；(4)洗板：0．01

6、MPBS洗涤3次，每次浸泡1分钟左右；(5)加酶标工作液：除零孔外，每孔加入0．1ml的ABC工作液0．1ml，37。C反应30分钟；(6)洗板：0．01MPBS洗涤5次，每次浸泡1分钟左右；(7)显色：按每孔90ul依次加入TMB显色液，37。C避光反应20分钟；(8)终止：按每孔0．1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色；(9)测定：将TMB空白显色孔设为对照，所有标准品和样品的吸光值减去TMB空白显色孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标，根据样品的吸光值在坐标上找出

7、对应的浓度。1．3统计学处理大鼠血清TGF-B1的含量用均数±标准差(i±S)表示，采用SPSS17．0软件对数据进行分析，两两样本均数比较采用t检验。P

8、，经照射的B、D组大鼠TGF-131水平逐渐升高，与对照组相比，有统计学差异(P<0．05)；而接受药物的大鼠，即C组血清中TGF-13l未见明显变化，与对照组相比无统计学差异(P)O．05)；B、D组大鼠分别与C组大鼠比较，血清中TGF-131的表达有统计学差异(P<0．05)，但B、D两组大鼠的血清TGF—B1的表达水平经分析后，没有统计学意义(P>O．05)。见表1。表1各组在不