贝氏隐孢子虫rhomboid基因的生物信息学分析及其核酸疫苗的免疫保护效果研究

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1、分类号：S墨52：22密级：玉中文论文题目：洳≥：j～螬硕士学位论文⑧单位代码：学号：10335英文论文题目：．BioinformaticsAnalysisofCrvptosporidium．baileviRhomboidandImmunoprotective墅望照YQ￡i!签盟望￡!星i￡△￡i丛坠￡竺i望星且医隐孢王虫坠Q磐坠Q地基固煎生堑焦!壑堂佥堑一／㈣嬲论文评阅人1：评阅人2：评阅人3：评阅人4：评阅人5：⑧论文作者签名：益窒指导教师签名：卫丛必～答辩委员会主席：委员1：委员2：委员3：委员4：委员5：一一一一一盟邋麟一雌监方一盗杜一胡一李一一一

2、一一一医一堕院一堕兰堕堂学一堂学一堂学一学一学一盐盟型型科一塑业一塑物一塑塑盔盟边边堂笪堂学一堂盔江一盔大一盔江一逝江一江一江一⋯一一1一●一一---⋯-．BioinformaticsAnalysisofCtTptosporidiumhaileFtl1I．●．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯一VaccineByXueSupervisor：ProfessorDuAifangADissertationSubmittedinpartialfulfillmentofrequirem

3、entsforthedegreeofMasterofVeterinaryinAgricultureCollegeofAnimalSciencesZhejiangUniversityHangzhou，P．R．ChinaJan，2014浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿态堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并

4、表示谢意。学位论文作者签名：该、寥签字日期：2。l牛年弓月乩日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解浙江太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙堑太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：蓖秀签字日期：20I毕年弓月2L日日锄张倒签字日期：yf￥年多月≥>课题来源：浙江省重大科技专项重点农业项目编号：2012C12009．2浙江大学摘要硕士学位论文

5、摘要隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种重要的顶复门原虫，主要寄生于宿主的呼吸道和消化道上皮细胞，引起隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)。该病在人、动物和自然界中广泛存在，对免疫功能低下的个体危害尤为严重，常导致持续性腹泻或营养不良，甚至危及生命。目前，对于隐孢子虫病尚无有效防治措施，探索候选靶抗原的结构和功能特性，从而制备特异性抗体和疫苗成为了该领域研究的新方向。本研究将GenBank中发表的C．parvum、chominis和cmuris的菱形体蛋白基因序列进行比对分析，设计合成该基因保守片段的l对特异性引物，以贝氏隐孢子虫基

6、因组DNA作为模板，通过PCR扩增出CbROM基因保守片段，采用染色体步移技术获得基因片段3’端和5’端未知核苷酸序列，对所得序列进行测序并拼接。对所获得序列的生物信息学分析表明，该基因的开放阅读框大小为1422bp，编码473个氨基酸，与C．parvum、Chominis和C．muris的相应基因进行比对分析发现，核苷酸同源性分别为68．2％、66．7％、59．6％，氨基酸序列同源性分别为61．8％、68．6％、51．6％。基因所编码蛋白质的理论分子量为52．7kDa，等电点为8．65，是疏水性蛋白质，含有7个串连的跨膜螺旋区，无信号肽；该基因含有典型的

7、菱形体蛋白相关保守结构域，属于菱形体蛋白酶家族；功能位点分析结果显示，CbROM蛋白序列包含6个N．糖基化位点，2个cAMP、cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点，8个蛋白激酶C磷酸化位点，7个酪蛋白激酶II磷酸化位点和10个N．豆蔻酰化位点；二级结构中包含洳螺旋38．27％，p折叠16。70％和无规则卷曲45．03％。以cbaileyi总RNA为模板，结合RT-PCR和巢氏PCR方法，扩增CbROM基因，克隆至pMDl8．TSimple载体，测序鉴定序列正确后，经SacI和XpnI双酶切，亚克隆至pEGFP．C2真核表达载体，构建pEGFP．CbROM真核表

8、达质粒，采用脂质体介导法，将阳性重组质粒瞬时转染入CEF细胞；通过