壮筋续骨汤对骨折大鼠血清gh水平骨痂组织ghr表达的影响

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1、万方数据第一章材料与方法生物组织自动脱水机，TC．120型，湖北泰维科技公司；生物组织自动包埋机TB一718型，湖北泰维科技公司；生物组织自动包埋机(冷台)，TB一718型，湖北泰维科技公司；电热恒温培养箱，HH．B11，上海跃进医疗器械厂；红外线干燥箱，YHG400型，上海跃进医疗器械厂：隔水式电热恒温箱，PYX．DHS—X，上海跃进医疗器械厂；微量移液器，10．1009LGilson，法国。1．2方法1．2．1建立实验动物模型：实验大鼠用10％水合氮醛(300mg瓜g)腹腔注射麻醉，俯卧固定，皮肤消毒，无菌操作，用低速牙科

2、钻(夹装0．2mm厚度锯片)在股骨中段(大转子下O．5cm)切断股骨，克氏针髓腔逆行固定[8]。假手术组大鼠不切断股骨，缝合切口，无菌包扎。动物放置笼中，自由活动与进食。存活率100％。1．2．2干预j治疗：根据清代赵濂《伤科大成》记载，本院制剂室依据国中医药发(2009)3号文件要求，制备壮筋续骨汤，最终药液250ml，含生药1259，浓度0．59／ml。．20。C储存。根据前期研究的理想结果【8】，每日1．259／kg(2．5ml／kg)灌胃，每曰1次，连续28天。假手术组和对照组同步给予等量的生理盐水。1．3评价指标：每

3、组于治疗后7、14、21、28天各取6只动物，水合氮醛麻醉，进行观察研究。1．3．1X线观察：X线摄片，观察骨折愈合情况。1．3．2解剖观察：完整取出股骨，剔除多余软组织，照相记录骨折愈合情况。1．3．3苏木精．伊红染色：取出股骨，剔除多余软组织，生理盐水洗涤，置4％1拘I多聚甲醛固定24h，蒸馏水浸泡4h，再置于20％乙二胺四乙酸(EDTA)溶液脱钙15d。然后截取骨痂组织，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，沿股骨纵轴连续切片，厚59m，贴于载玻片。苏木精．伊红(HE)染色观察骨痂组织结构。1．3．4酶联免疫吸附试验(ELIS

4、A)：实验结束后，禁食12h，经腹主动脉取血4ml，4000rpm离心10min，分离血清，双抗夹心ELISAkit测定血清GH浓度，以3万方数据青岛大学硕士学位论文ng／mL表示。1．3．5免疫组化染色：1)切片常规脱蜡、水化；2)3％H202处理10min，洗涤2min×3次；3)室温消化8min，水洗5minx3次；4)室温山羊血清封20min，甩干；5)滴加一抗，37℃孵育2h，PBS洗3min×3次；6)滴加二抗，37℃孵育20min，PBS洗2minx3次；7)SABC，37℃孵育20min，PBS洗5min×4次

5、；8)室温DAB显色3-5min，水洗；9)脱水、透明、封片；10)在400倍光镜下观察细胞质出现棕色颗粒者为阳性细胞，阴性对照切片以O．01mol／LPBS替代一抗染色，不出现阳性着色。在400倍光学显微镜下随机观察5个不重叠的视野，Image-ProPlus图像处理与分析系统进行灰度分析吸光度值(A)。以阳性细胞A一背景A表示阳性表达程度，取其均值。1．3．6抗酒石酸酸性磷酸酶染色【9】：取盖玻片，esecL戊二醛中4。C固定7min，蒸馏水漂洗3遍。0．125mLGBC溶液和0．125mL亚硝酸盐溶液，轻轻混匀30S，静

6、止2min。取先预热的11．25mL三蒸水，将第二步制得的混合液加入，并分别依次加入下列物质：0．125mL萘酚AS．BI磷酸盐溶液，0．5mL醋酸溶液，0．25mL酒石酸溶液，制得染色液。将盖玻片放入染色液中，37。C孵育1h。三蒸水冲洗3遍，光镜下观察TRAP染色后，镜下破骨细胞呈多核巨细胞(>3个细胞核)计为破骨细胞，TRAP阳性表现为酒红色颗粒。观察破骨细胞与GHR分布关系。1．4统计学处理：所有数据以x士s表示，采用SPSSl7．0统计软件处理。4万方数据第二章结果第2章结果1血清GH水平ELISA结果显示n3

7、，术

8、后7天、14天、21天、28天，假手术组大鼠血清GH水平未见显著性变化，P>0．05；模型组和治疗组大鼠在术后第7天、14天、21天也未见显著性变化，P>0．05，但均显著高于假手术组，P<0．05，在第28天则显著下降，P<0．05。血清GH水平在术后7天、14天、21天模型组和治疗组大鼠之间无显著差异，P>0．05，但术后第28天治疗组血清GH水平显著高于假手术组及对照组，P<0．05。见表1、图1。表1血清GH含量(平均数4-标准差)8与对照组比较，P<0．05；6与假手术组比较，P<0．05；。与21天比较，P<0．0

9、5图1血清GH含量(平均数士标准差)2骨痂组织GHR表达强度免疫组化检测显示，术后7天、14天、21天、28天，假手术组大鼠骨痂组织5万方数据中GHR表达强度未见显著性变化，P>O．05；模型组和治疗组大鼠在术后第7天、14天、21天也未见显著性变化，P>O．05，但均显著高