脑内嗅鞘细胞移植对msod1g93a als大鼠治疗作用的研究

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1、泰山医学院硕士学位论文脑内嗅鞘细胞移植对mSOD1G93AALS大鼠治疗作用的研究姓名：赵艳秀申请学位级别：硕士专业：神经生物学指导教师：黄红云；段耀奎2011-12脑内嗅鞘细胞移植对mSODlG93AALS大鼠治疗作用的研究研究生：赵艳秀专业：神经生物学导师：黄红云教授段耀奎教授中文摘要目的观察荧光大鼠嗅球来源的嗅鞘细胞经颅移植到放射冠后对msODlG93A转基因ALS大鼠的发病时间、生存率、行为学等方面的影响，探讨嗅鞘细胞经颅移植到放射冠对mSODlG93A转基因ALS大鼠的治疗作用及相关机制，为临床ALS治疗提供相

2、关的实验学证据。方法lmsODlG93A转基因大鼠的筛选鉴定出生21天的仔鼠剪鼠尾适量，DNA提取后PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统下观察。2嗅鞘细胞培养新生1周的SD大鼠，荧光显微镜下观察，筛选出荧光表现阳性的大鼠备用，先用碘伏消毒其全身，尤其是头颈部，再用酒精喷洒脱碘后拿到超净工作台内，用消毒剪沿颈部剪下，换剪刀后沿头顶正中线剪开皮肤和颅骨，取出双侧嗅球，放于冰块上的DF一12内，清洗三遍，解剖镜下剥膜，头部难剥离部分可适当保留，用眼科剪剪成1立方毫米大小的组织块，将剪碎的组织块移入15m1离心管

3、，用弯头吸管来回轻轻吹打，制成细胞悬液，胰蛋白酶消化后收集细胞，以13％的血清培养基制成细胞悬液平均铺入经多聚赖氨酸包板后的细胞培养板中，在C02培养箱中培养。3嗅鞘细胞鉴定包括形态学鉴定和免疫荧光染色鉴定，形态学鉴定可在倒置显微镜下观察细胞的形态，类似小蝌蚪样，胞体呈球形或星形，周围有突起。Hoechst标记细胞核，同时用P75NGFR和S．100染色进行免疫荧光鉴定，激光共聚焦显微镜下观察，染色双阳性细胞与总细胞数量相比即得到嗅鞘细胞的纯度。4嗅鞘细胞移植嗅鞘细胞移植所用仪器是立体定位仪，对象是90日龄野生型大鼠和m

4、SODlG93A转基因大鼠。大鼠4％水合氯醛麻醉后，俯卧于手术台上，用立体定位仪固定，去掉大鼠头部的毛发，在颅骨距离前囟2毫米，中线右侧1．5毫米的位置开一个直径大约5毫米的孔，玻璃微注射器插入到放射冠(距离表面2．75毫米)。将5微升的细胞悬液(约个5×105嗅鞘细胞)或者是DFl2在十分钟之内缓慢的注射到孔内。手术过程中不使用环胞霉素，而在术后所有动物连续三天按每天每千克体重10毫克的量皮下注射青霉素预防感染。5行为学实验所有实验动物自出生后90天起进行发病时间、生存时问、体重及相应行为学实验的观察。6运动神经元计数

5、所有实验动物分别于细胞移植后5周(125天)及7周(139天)取大脑皮层和腰段脊髓进行组织学检测。细胞移植后五周取材的脊髓做冠状切片的尼氏染色，计算各组的神经元数量。显微镜下观察运动神经元，记录细胞形态完整的运动神经元细胞数量。7免疫荧光组织化学细胞移植后五周和七周取材的冰冻切片做Cm汀蛋白的免疫组织化学染色。冰冻切片机切片后将片子放到37度烤箱内烤30分钟，进行防脱片处理，放到摇床上用PBS洗三遍，血清孵育2h后加入一抗过夜，复温后再洗三遍，加入二抗室温孵育1小时，Hoechst进行细胞核染色，封片保存待观察。8Wes

6、ternBlot处死大鼠后快速取所需要的组织并提取蛋白，测定浓度后进行琼脂糖凝胶电泳，将电泳产物进行硝酸纤维素转膜，产物进行封闭杂交，暗室内曝光，凝胶图像分析仪扫描得到的图像，QuantityOne软件分析条带光密度。结果1移植后嗅鞘细胞的追踪观察嗅鞘细胞移植到SODlG93A转基因大鼠放射冠两周后，荧光显微镜下观察表达绿荧光蛋白的嗅鞘细胞在移植大鼠的放射冠移植点周围弥散分布。移植后5周，弥散到更远的地方，移植后7周，逐渐消失，但仍有少量存活。2临床评估及行为学实验各组大鼠的四肢出现异常的平均时间均为125天左右，即各组

7、发病时间没有统计学意义。而嗅鞘细胞移植组的生存时间和疾病过程中的各项指标均明显好于其他几组，即细胞移植延长了大鼠的生存时间，改善了发病到死亡过程中大鼠的各项生理指标。3运动神经元检测大脑皮层和腰段脊髓的前角运动神经元尼氏染色显示，SODlG93A转基因大鼠发病后出现运动神经元的大量死亡，并有统计学差异(p

8、组又高于未经治疗的其他两组，并均有统计学差异。而培养基注射组和SODlG93A组的Cm盯蛋白水平无统计学差异(p<0．01)。结论嗅鞘细胞移植可以延缓SODlG93A转基因大鼠的发病时间，改善发病后大鼠的运动功能，并使其生存时间相应延长，移植后的嗅鞘细胞可以在大鼠体内存活至少7周，同时还可以抑制大脑皮层及脊髓运动神经