日本榧树果实中抑制人妇科肿瘤细胞增殖活性成分及其作用机制的研究

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1、河北医科大学硕士学位论文日本榧树果实中抑制人妇科肿瘤细胞增殖活性成分及其作用机制的研究姓名：代丽丽申请学位级别：硕士专业：妇产科学指导教师：张红真；董玫201203中文摘要日本榧树果实中抑制人妇科肿瘤细胞增殖活性成分及其作用机制的研究摘要目的：日本榧树(TorreyanllciferL．)是日本、朝鲜和中国特有的一种红豆杉科植物，其种子有很强的杀虫活性，在我国和朝鲜用于治疗绦虫感染，在日本民间用作流产药。关于日本榧树的化学成分研究主要集中在它的叶子和心材上，其根供药用，具有健胃、利尿、祛痰和驱虫等功效。本实

2、验以人子宫内膜癌细胞株(I-mC．1)、人子宫颈癌细胞株(HeLa)、人卵巢囊腺癌细胞株(HAC．2)、人卵巢透明癌细胞株(HOC．21)和人卵巢透明癌细胞株(SHIN．3)为材料，研究日本榧树果实中纯化得到的3种二萜类化合物(18．羟基弥罗松酚、kayadiol和花柏酚)对这5种妇科肿瘤细胞增殖的抑制作用，并以HEC．1细胞为代表，进一步探讨kayadiol抑制HEC．1细胞增殖的作用机制。’方法：1MTI'(四甲基偶氮唑蓝)LL色法1．1肿瘤细胞株悬液制备’用RPMI．1640完全培养基调整实验用肿瘤细

3、胞株浓度为2×105个／mL的细胞悬液备用。1．2体外抑瘤实验取对数生长期的实验用肿瘤细胞，将细胞悬浮接种于96孔板，每孔50此(含1×104个细胞)，分别加入溶剂对照(终浓度O．1％DMSO)、阳性对照(顺铂)和终浓度为1、lO和100¨mol／L的5种二萜类化合物各50止，每组均设3个复孔，置于37℃、5％C02培养箱中培养44h，然后各孔加入5mg／mL的MTT10皿。培养4h后，弃去培养孔中上清，每孔加入DMSO150止，振荡10min，充分溶解结晶，用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值(OD值)，并计

4、算肿瘤细胞生存率，细胞生存率(％)=(实验组OD值／对照组OD值)×100％。实验数据用TheSPSSsystemV13．0软件进行处理，受试药物对细胞的浓度．效应曲线用Hill数学模型拟合，计算药物的半数抑制浓度(IC50)值。中文摘要2凋亡细胞原位标记与半定量分析取对数生长期的HEC．1细胞，将细胞悬浮接种于8孔Chamberslide，每孔100止(含2x104个细胞)，分别加入溶剂对照(终浓度0．1％DMSO)矛I]终浓度为10prnol／L的kayadiol100．此，置于饱和湿度、37℃和5％C

5、02培养箱中培养12h和24h。采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测。每张切片拍摄5个阳性视野，分别计数每视野正常细胞数和带有荧光的凋亡细胞数，以平均阳性细胞所占的正常细胞的百分比作为细胞凋亡率(apoptotierate，AR)。3Westemblotting检测取对数生长期的HEC．1细胞，按2x106个细胞／培养皿接种。加入终浓度为10gmol／L的顺铂和kayadiol的培养基，培养细胞48h，离心收集细胞，PBS漂洗细胞，加上样缓冲液100止，

6、剧烈震荡后冰浴下超声波处理1min。100℃加热10min使蛋白质变性，12000r／min离心10min，取上清液测定蛋白浓度。取50岖蛋白在SDS-PAGE电泳下分离，电转移至硝酸纤维膜(NC膜)，用5％脱脂奶粉于室温下摇动封闭膜2h。弃封闭液，用lxTBS．T洗膜3次，每次15min。膜在抗Bax多克隆抗体(1：500)和抗caspase．3多克隆抗体(1：700)稀释液中室温过夜孵育，1xTBS．T洗膜3次，每次15min，在二抗稀释液(抗鼠l：5000)中孵育40min。再次沈膜后加入ECL试剂，

7、反应lmin，用X片曝光1．10min后，显影。4半胱天冬酶抑制剂对kayadiol抑制HEC．1细胞增殖的翻转作用取对数生长期的HEC．1细胞，将细胞悬浮接种于96孔板，每孔50此(含lx104个细胞)，分别加入含有半胱天冬酶抑制剂终浓度为l、10和100gmol／Lkayadiol和不含半胱天冬酶抑制剂的kayadiol，各50止，每组均设3复孔，置于培养箱中培养44h，各孔加入5mg／mL的MTT10gL。继续培养4h后，弃去培养孔中上清，每孔加入DMSO150此，振荡10min，充分溶解结晶，测定O

8、D值，并计算细胞生存率。结果：lMaT(四甲基偶氮唑蓝’)比色法结果’本实验采用MTT法探讨了3种二萜类化合物(18．羟基弥罗松酚，kayadiol，花柏酚)对5种妇科肿瘤细胞增殖活性的影响。18．羟基弥罗松酚、kayadio和花柏酚对5种妇科肿瘤细胞增值活性有不同的抑制活性。中文摘要其中kayadio对上述5种细胞的增殖显示强的抑制活性，1、lO和100Ⅳnol／Lkayadio处理的HEC．1细胞，其细胞生存