构建高效利用纤维二糖酿酒酵母的研究

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1、构建高效利用纤维二糖酿酒酵母的研究EngineeringSaccharomycescerevisiaeforrapidcellobioseutilization学科专业：生物化工研究生：胡梦龙指导教师：元英进教授天津大学化工学院二零一四年六月万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献

2、均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日万方数据摘要同步糖化发酵在纤维素乙醇的生产中被广泛应用，但是在同步糖化发酵的过程中存

3、在两个瓶颈问题：酶解过程中产生的纤维二糖抑制纤维素酶的活性；酿酒酵母的最适发酵温度与纤维素酶的最适温度不匹配。在本研究中，表达纤维二糖转运蛋白（CDT）和β-葡萄糖苷酶（BGL）的基因被整合到酵母质粒pRS426上，将所得质粒pRS426-cdt-1-gh1-1导入到工业酿酒酵母SyBE001601中获得菌株SyBE001602。对菌株SyBE001602进行进化工程改造后得到菌株SyBE001603。与SyBE001602相比，SyBE001603的糖耗速率提高了1.8倍，达到2.35g/L/h，乙醇产率提升了

4、3.9倍，达到1.17g/L/h，CDT的基因表达量提升了5.74倍，BGL的基因表达量提升了0.21倍。将CDT与BGL的基因在五个实验室底盘菌株中进行过表达以研究CDT与BGL的基因表达量对菌株纤维二糖利用能力的影响，发现过表达CDT与BGL的基因都会提高菌株的纤维二糖利用能力，但是提高的程度与底盘菌株的基因背景有关。对菌株SyBE001603的发酵性能进行表征，发现菌株在38°C条件下纤维二糖利用速率与30°C条件下利用速率基本一致，在34°C条件下菌株具有最高的发酵速率，在42°C条件下依然可以在30小时

5、内将糖耗完。当纤维二糖浓度为80g/L时，在34°C条件菌株的纤维二糖消耗速率可以达到3.67g/L/h，在38°C条件仍可达到3.04g/L/h。在pH为4.5的环境中菌株仍然可以正常生长，当pH大于5时菌株具有较快的生长速率。将菌株SyBE001603应用于同步糖化发酵中，可以发现同步糖化发酵过程中纤维二糖的积累被消除，纤维二糖对纤维素酶的抑制作用被解除，乙醇的产率显著提高，最终乙醇的得率提高了23%。菌株SyBE001603对纤维素水解液中的抑制剂也具有一定的耐受能力。在纤维二糖作为单一碳源的条件下，菌株可

6、以分别耐受3g/L糠醛、1.5g/L苯酚、4g/L乙酸以及含有2g/L糠醛、0.8g/L苯酚、1.5g/L乙酸的复合抑制剂，有望应用于工业生产中。关键词：纤维素乙醇纤维二糖工业菌株同步糖化发酵合成生物学万方数据ABSTRACTSimultaneoussaccharificationandfermentationiswidelyappliedintheproductionofcellulosicethanol.However,therearetwobottlenecksinthesimultaneoussaccha

7、rificationandfermentationprocess:theinhibitionoftheaccumulatedcellobioseoncellulasesandthemismatchbetweenthetemperaturesforenzymatichydrolysisandfermentation.Inthisstudy,genesencodingcellobiosetransporter(CDT)andβ-glucosidase(BGL)wereintegratedonthepRS426plas

8、midandintroducedintoanindustrialSaccharomycescerevisiaestrainSyBE001601.StrainSyBE001602wasobtainedandevolutionengineeringwascarriedouttoimprovethecellobioseutilizationcapacityofthestrain