d1蛋白酶的分离纯化及其与抑制剂先导化合物的相互作用

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1、⑧璜每学位论走硒凑翳麟S徽SI黪质，之后到确定药物靶点，针对药物靶点设计出药物【ll】。压矾＼一，图1．1药物发现过程示意图【lll为了提高整个药物研发效率，新药研发除了靶标发现的确认外，还包括药物作用机制研究、先导化合物选择、小分子化合物筛选和优化、生物活性研究等方面的内容。1．1．2靶标导向的药物发现从20世纪90年代开始，随着各学科的发展，药物设计进入了一个新的阶段，即合理药物设计的阶段。所谓合理药物设计，是依据生物化学、酶学、分子生物学、遗传学、信息学以及计算化学等学科的研究成果，针对这些基础研究中所揭示的包括酶、受体、离子通道以及核酸等潜在的药物设计靶点，并参考其他内源性配

2、体或天然产物底物的化学结构特征设计出合理的药物分子，以发现选择性作用于某种靶点的新药，这是目前新药发现的主要方向。内源性活性物质或者外源性小分子药物(广泛称为配体(1ig勰d))作用于生物体内的靶标(ta玛ct)，从而引起生物活性的变化；基于对疾病过程的分子病理生理学的研究，生物体的酶、受体、离子通道、核酸等为潜在的药物作用靶标或靶点，广义地称为受体(rec印tOr)【12】。图1．2说明的是配体和受体相互作用时的关系图【13】，配体与受体结合时，彼此存在静电相互作用、氢键相互作用、范德华力相互作用和疏水相互作用。配体与受体结合必须满足互补匹配原则即配体与受体几何形状互补匹配、静电相

3、互作用互补匹配(正电荷对应负电荷)、氢键相互作用互补匹配(氢键供体对应氢键受体)、疏水相互作用互补匹配(疏水区对应疏水区)。在配体与受体对接过程中，通过上述两者的形状互补、性质互补，两者各自改3旗出学位论史强瘩窭譬脒’S7HESls变其构象，以适应对方的要求而达到对接的契合状态，这就是所谓的“诱导契合一机制。合理药物设计就是根据靶标生物大分子三维结构，考查配体小分子(内源性配体、天然药物或合成小分子)的化学结构特征，寻找和设计合理的药物分子，以发现选择性作用于靶标又具有生物活性的药物先导化合物；或根据靶标三维结构直接设计具有生物活性的配体。以此发现、设计的药物先导化合物，可以进一步设

4、计、研制出药物，这种药物往往活性强、作用专一、副作用低，称为合理药物设计(rationaldmgd豁ign)。e—e■电相互作用D～O氯蕾相互作用口—口麓水相互作用图1．2配体．受体互补匹配示意图以抗寄生虫药物设计为例：1993年C城stine．黜ng等人研究了抗血吸虫和抗疟药物。血吸虫幼虫囊尾可分泌一种弹性酶(E1ataSe)，如果血吸虫对水有感染，人的表皮接触到寄生虫感染的水，这种酶则会侵入宿主的皮肤，逐渐产生血吸虫病，因此囊尾幼虫弹性酶可作为设计这种酶抑制剂的靶标。在疟原虫感染的红细胞中，疟原虫分泌出半胱氨酸蛋白酶(CysteilleProte弱e)，分解血红蛋白作为管养的主要

5、来源，因此这种酶可作为抗疟药物设计的靶标。虽然目前可以通过分离纯化得到这两种酶，它们的一级结构也已经得到测定，但它们的三维结构尚未得到测定和解析。但可利用7种哺乳动物血清蛋白酶模建囊层幼虫弹性酶，用木瓜蛋白酶等两种酶模建半胱氨酸蛋白酶，分别得到这两种酶的三维结构，然后采用砧皿ER程序对这些三维结构做能量最小化的改进，应用D1)CK6．0分子对接程序搜索精细化学品数据库FCD口ineC机帕畦calD搬to巧，现已与MDL／ACD合并，MDL：M01∞ul缸Desi弘LiInited掀)mationS舛锄，hc，ACD：111eAVailableChemicalsD础丛e，FCD数据库中

6、含有从CSDC觚l嘶dgeS眦turcDatab勰e选择出的55313个商品化的小分子)，4⑨壤士学往论走瑙舞霪T霹眵S7HE国8根据对搜索的受体一配体互补的复合物进行判断、筛选，通过对所选择的化合物进行活性检测发现有9．6％的化合物(即52个中的5个)对弹性酶，对半胱氨酸蛋白酶有12．9％的化合物(即31个中的4个)的抑制浓度小于lOO肿∞儿。其中3个化合物(图1．3a、b、C)的抑制浓度均小于10Ⅳmol／I。，化合物a和b对弹性酶的鼢值分别为3肛mol／L和6弘mol／L，化合物c对半胱氨酸酶的局为6肛mo儿。因此这3个化合物都被筛选为开发更高活性药物的先导化合物【14'15j

7、。(b)(c)图1．3筛选出的弹性酶和半胱氨酸酶抑制剂先导化合物的结构如果根据对物质结构与功能关系的了解，借助于计算机技术，将生物化学、分子生物学、药物化学、药理学等知识综合起来，进行新型药物的计算机辅助分子设计，就能合成出成数以万计的新化合物进行定向筛选，将会大大提高创新药物研制的成功率。1．1．3靶标与先导化合物相互作用研究传统的先导药物的发掘可分为三类：(1)从动物、植物及微生物中分离、提纯天然产物；(2)对现有的化合物数据库进行筛选；(3)在对结构