毛细管区带电泳测定D1蛋白酶的活性及其抑制剂先导化合物的筛选.pdf

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1、第39卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第11期2011年11月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1758～1761毛细管区带电泳测定D1蛋白酶的活性及其抑制剂先导化合物的筛选陈腊月李伟国黄雪英刘中来刘艳丽冯璐廖宏珊熊国梅祁超(华中师范大学生命科学学院遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室，华中师范大学化学学院农药与化学生物学教育部重点实验室，武汉430079)摘要建立了毛细管区带电泳技术快速测定D1蛋白酶活性及其抑制剂先导化合物的筛选方法。实验选用未涂层熔融石英毛细管(43cm~75¨m)和磷酸盐缓冲溶液(50mmol／L，pH3．O)作为分

2、离介质，运行电压18kV，测定了D1蛋白酶的活性并对部分抑制剂先导化合物进行了筛选。结果表明，ITP26和ITP21两种异嗯唑噻唑哌啶类先导化合物对蛋白酶活性具有抑制作用，抑制率分别为26％和13％。关键词D1蛋白酶；毛细管区带电泳；活性；先导化合物引言D1蛋白酶(D1C—terminalprocessingprotease，CtpA)是由叶绿体核ccpA基因编码、含有389个氨基酸残基的单亚基蛋白，分子量约为45kDa，广泛存在于各种生物体中]。其作用主要是通过剪切D1蛋白前体C端延伸的肽段，促使其转化成具有活性的D1蛋白，用于光合系统II中锰簇复合物的组装，是植物进行光合作用所必须的

3、步骤，因此D1蛋白酶被认为是一种新型优异的广谱除草剂作用靶标翻。开发以D1蛋白酶为靶标的新型农药，首先需要获得具有生物活性的重组蛋白酶和选择合适的先导化合物抑制活性筛选方法。D1蛋白酶活性检测通常采用两种方法：一是采用前体蛋白作为反应底物，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sDs_PAGE)迁移检测反应产物吲；二是以合成的D1前体蛋白剪切位点附近的肽段作为反应底物，剪切后的肽段采用高效液相色谱(HPLC)进行分离和检测。前者凝胶迁移法准确度较低，不适合大规模操作；后者的准确度较高，但由于采用高效液相色谱法，分析过程耗时较多，也不适合快速和高通量筛选的要求。毛细管电泳(cE)具有灵敏度高、环境污染少

4、、进样量小、样品不需前处理、操作简单等优点，在生物工程、药物分析和检测等领域获得了广泛应用，可用于多肽分离和蛋白质的分析。本研究采用毛细管区带电泳建立了重组D1蛋白酶生物活性的测定方法，并用于抑制剂先导化合物筛选。2实验部分2．1仪器与试剂P／ACEMDQ型毛细管电泳仪(美国Beckman-Coulter公司)；熔融石英毛细管柱(河北永年锐沣色谱器件公司，50cmx75um，有效长度43cm)；AKTApurifier100蛋白纯化系统(GEHealthcare，美国)。9肽(9p,AIEAPSTNG)、24肽(24P,VMHERNAHNFPLDLAAIEAPSTNG)均由上海吉尔生化公

5、司合成；异丙基一J3一D一硫代吡喃半乳糖苷(IPTG，北京鼎国生物技术有限公司)；其它试剂均为国产分析纯。2．2实验方法2．2．1重组蛋白酶的表达和纯化D1蛋白酶的表达和纯化参照文献[8]的方法，将纯化得到的蛋白溶液超滤浓缩，采用HiTrap脱盐柱除去咪唑，进行SDS—PAGE电泳鉴定和分析。2．2．2毛细管电泳分离条件的选择毛细管电泳分离选用磷酸盐缓冲液，以未涂层的石英毛细管为分离柱(有效长度43cm，内径75um)，温度设定为25℃，分离电压l8kV，进样压力3．45kPa，进样时间201卜0307收稿；2011—05—26接受本文系国家自然科学基金(Nos．20702017，306

6、70429)，湖北省自然科学基金(Nos．2007ABA141，2010CDB01206，2009CDB234)资助E—mail：weiguoli@mail．ccnu．edu．cn；qichao@mail．ccnu．edu．cn第11期陈腊月等：毛细管区带电泳测定Dl蛋白酶的活性及其抑制剂先导化合物的筛选10S，检测波长为220am。毛细管柱使用前先用1mol／LNaOH冲洗30rain，再用0．1mol／LNaOH活化lh。进样前再分别用0．1mol／LNaOH、超纯水和运行缓冲液冲洗5，5和15min。在样品管中分别加入2L2mmol／L多肽溶液和48L磷酸盐缓冲溶液(50mmol／

7、L、pH8．0)，充分混匀，采用毛细管电泳自动进样分离和检测，以磷酸盐溶液作为对照，确定多肽的保留时间。2．2．3D1蛋白酶活性测定及抑制剂先导化合物的筛选在EP管中分别加入20D1蛋白酶(1g／L)和2L24P溶液(2mmol／L)，用运行缓冲液补足至40L，混匀。于25℃恒温水浴中反应6h，反应结束后加入10磷酸盐缓冲液(50mmol／L，pH2．0)终止反应。离心10min后取20L上清液进行毛细管电泳分析，以多肽峰面积确定酶