（食品科学专业论文）柚子酒的微生物脱苦技术研究

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1、摘要柚子酒的微生物脱苦技术研究食品科学专业硕士研究生：李睿晓指导老师：阚建全教授杜木英副教授摘要柚子是典型的热带、亚热带水果，其色泽艳丽，香气独特，果肉晶莹脆嫩，酸甜可口、风味独特，具有较高的营养价值和保健功效。除鲜食外，柚子还可以加工成多种制品。经柚子榨汁发酵制得的柚子酒酒度低，具有柚子的天然香味、丰富的营养和保健价值，越来越受到现代人的喜爱。但由于柚子酒苦味重，许多消费者难以接受。因此，对柚子酒脱苦技术的研究有助于提高柚子酒的规模化发展。本文对柚子酒的微生物脱苦技术进行了相关研究。以腐烂柚皮、腐烂柚子果实堆积处的土壤、柚子林木下的土壤以及实验室保藏的黑曲霉菌种

2、作为菌种来源，筛选出具有高产柚苷酶的菌种，并对其进行诱变选育，进一步提高菌株的产酶性能。研究高产突变菌株的最佳摇瓶发酵条件，并利用高产突变菌株在最佳摇瓶发酵条件下制得的柚苛酶粗酶液对生产柚子酒的柚汁进行脱苦条件的初步研究，确定最佳的脱苦条件，来实现柚子酒的微生物脱苦技术研究。主要研究结果如下：1．从腐烂柚子果实及柚子果园土壤中初步分离纯化出128株真菌并保存，将其与实验室保存的23株黑曲霉一同进行半固体高层试管初筛。挑选53株高层试管中出现较明显透明溶解圈的菌株，对其中可测出透明圈厚度的36株菌株进行摇瓶发酵复筛，获得一株产柚苷酶酶活相对较高的菌株M53，其产酶活

3、性为507．0799／mL．min。对菌株M53的菌落及个体形态特征进行鉴定，初步确定菌株M53为黑曲霉属(AspergillusnigerM53)。2．在紫外照射2～4min结合O．2％的LiCI的诱变处理条件下，对野生型菌株M53进行诱变选育，在柚皮苷鉴定平板上进行初筛。挑取菌落生长旺盛、透明圈大的菌株，其中透明圈直径／菌落直径大于出发菌株M53(1．21)的突变菌株有31株，并对其进行摇瓶发酵复筛，测定酶活力。挑取23株产柚苷酶活力高于出发菌株M53(507．0799／mL．rain)的突变菌株，并对其编号、保存，其中突变菌株M53．7产酶活力最高，其产酶活

4、力为721．0899／mL．min，比出发菌株提高214．01个酶活单位，提高率为42．21％，通过突变株M53．7遗传稳定性的研究，得出该突变株产酶性能较稳定，并将其作为后续研究的菌株。3．确定了突变菌株M53．7的最佳碳、氮源，碳源为蔗糖，无机氮源为NI-14N03，有机氮两南大学硕十学位论文源为豆饼粉，并研究了不同浓度的无机盐CaCl2、MgS04·7H20和ZnS04对产酶的影响，确定其在培养基的添加量分别为0．1％、0．5％、O．1％。通过单因素试验，确定了发酵培养基中最佳碳源蔗糖、无机氮源NH4N03及有机碳源豆饼粉的添加范围。根据单因素试验结果，利用

5、正交试验设计确定了培养基中影响酶活的主要因素蔗糖、豆饼粉、NH4N03、K2HP04之间的最佳比例，按照四因素三水平正交设计表进行试验，得到了蔗糖、豆饼粉、NI-hN03、K2HP04的最佳浓度分别为0．5％、3．0％、1．O％、O．1％。4．对突变菌株M53．7的摇瓶发酵条件进行研究，得出最佳发酵条件：诱导物柚苷添加量0．05％；培养基初始pH为5．0；培养温度为28℃；接种量为0．3mL；培养基装量为30mL／250mL；吐温．80添加量0．15％，摇瓶发酵96h。在最适培养条件下进行产酶发酵，突变菌株M53．7的产酶能力维持在872．28I，tg／mL．mi

6、n左右，该菌株产酶的性能较稳定。5．利用突变菌株M53．7摇瓶发酵制得的柚苷酶粗酶液对柚子酒发酵生产中制备的柚汁进行脱苦处理的初步研究，确定添加8U／mL的发酵粗酶液、pH3．5、50℃处理60min，脱苦效果达到最好，脱苦率达到47．12％，既能有效脱除柚汁中含有的大量苦味物质，又能在之后的发酵生产中保持柚子酒的特有风味。本论文创新之处：以腐烂柚皮、腐烂柚子果实堆积处的士壤、柚子林木下的土壤以及实验室保藏的黑曲霉菌种作为菌种来源，筛选出具有高产柚苷酶的菌种M53；对菌种M53进行紫外线和LiCI复合诱变，选育出产酶性能显著提高的突变菌株M53．7：确立了突变菌株

7、M53．7的最佳发酵条件；进行了突变菌株M53．7的摇瓶发酵粗酶液对柚予酒脱苦效果的初步研究。结论：经自然筛选及诱变选育获得的突变菌株M53．7菌体生长速度快，产菌丝丰富，发酵产酶周期较短，产酶性能较稳定，是一株工业生产用的优良菌株米源；以突变菌株M53—7的摇瓶发酵粗酶液对柚汁进行脱苦既能有效脱除柚子酒中含有的大量苦味物质，又能在之后的发酵生产中保持柚子酒的特有风味。关键词：柚子酒脱苦技术微生物筛选柚苷酶发酵条件ⅡAbstractStudyonDebitteringTechnologywithMicroorganismofGrapefruitWineSuperv

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