人精子线粒体dna多重缺失和弱精子症相关性的研究

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1、温州医学院硕士学位论文人精子线粒体DNA多重缺失与弱精子症的相关性研究姓名：王吉莹申请学位级别：硕士专业：遗传学指导教师：管敏鑫；金龙金201103温州医学院硕士学位论文人精子线粒体DNA多重缺失与弱精子症的相关性研究中文摘要目的1、通过长片段PCR与巢式PCR方法，筛查弱精子症患者精子线粒体DNA多重缺失的发生情况。2、比较弱精子症患者精子标本线粒体DNA与正常精子标本之间多重缺失的差异。3、讨论线粒体DNA多重缺失和弱精子症的相互关系。方法1、根据病理学诊断结果收集男性弱精子症患者(不育组)精液标本59例，健康男性(

2、生育组)精液标本56例。2、通过手工法与试剂盒法相结合的方法提取精子总DNA，先用长片段PCR扩增线粒体DNA，然后设计巢式PCR，继续扩增长片段PCR扩增后的产物，以达到放大缺失条带的目的，再通过琼脂糖电泳方法来检测缺失的有无及缺失种类、数量和大小。3、通过T载体与缺失后扩增出的目的条带连接构建质粒，蓝白斑筛选后提取质粒PCR鉴定后测序，确定缺失片段的断裂位点。4、采用SPSS软件，用单向方差分析比较弱精子症患者与正常对照之间线粒体多重缺失数目(通过长片段PCR结合巢式PCR后所检测到的条带)和缺失平均大小的区别。结果

3、1、在59例不育组标本中检测到47例(80％)存在mtDNA缺失，其中单个缺失(只有一条缺失条带)有5例占8％，双重缺失(有2条缺失条带)有2例占3％，多重缺失(缺失条带大于2条)有40例占68％。在56例生育组标本中检测到36例(“％)存在mtDNA缺失，单个缺失9例占16％，双重缺失8例占14％，多重缺失19例占34％。不育组与可育组相比，在不育组中发生缺失的现象要严重，并且多重缺失所发生的比例更大，而可育组相对包含的缺失数目则较少。2、在不育组59例标本中共筛查到缺失片段205条，大小在lkb到8kb之间，平均片段

4、大小为6．29kb；可育组共筛查到缺失片段96条，大小在3kb到8kb之间，平均片段大小为5．9kb。其中在不育组中，6．1．8．0kb之间的大片段缺失3温州医学院硕士学位论文条带数在总缺失条带数中占72．68％，可育组中也发现了高比例(70．83％)的大片段缺失，然而两组在各缺失大小区间内筛查到的缺失条带数占各自总缺失条带数的百分比相似，没有显著性差异。3、克隆测序一例缺失片段，结果显示缺失区域位于线粒体DNAnt6847--14998之间，缺失片段长度为8152bp，为目前尚未报道发现的缺失位点。所筛查到的mtDNA

5、8152缺失在不育组和生育组中所占比例分别为68％和55％。结论l、从缺失的种类和数量来看，不育组发生缺失的现象要比可育组严重，并且多重缺失所占的比例达到68％，推测精子mtDNA的缺失可能是影响精子活动力的原因之一，并且在多种缺失种类中，多重缺失对精子活动力的影响更大。2、从缺失条带的大小来看，在不育组中，6．1．8．0kb之间的大片段缺失条带数在总缺失条带数中占72．68％，推测精子mtDNA中的大片段缺失对精子活动力有重要的影响。然而在不育组与可育组之间，各种大小的缺失片段所占比例趋势相似，在可育组中也存在大片段的

6、缺失条带，推测这些缺失条带可能是来自于可育组中精子活动力差的c级与d级精子。3、实验中筛查到一例这mtDNA8152缺失，缺失导致了线粒体结构基因COI、CO口、ATPase6／8、a衄：ND4、ND4L、肋5、ND6，Cytb和9个tRNAs的缺失。经过电泳鉴定，这种mtDNA8152bp缺失在不育组和可育组中都有出现，可能会导致大部分的呼吸链功能缺陷，造成精子氧化磷酸化与ATP产生障碍，影响精子的运动能力。关键词线粒体DNA：弱精子症；大片段缺失；Long-PCR；巢式PCR4温州医学院硕士学位论文Correlati

7、onAnalysisbetweenHumanSpermMitochondrialDNAMultipleDeletionsandAsthenospermiaobjeefive1、T0detecttheincidenceofmultipledeletionsinmitochondrialDNAoftheasthenospermiapatientsbYlong-rangePCRandnestedPCR．2、FindthedifferenceinmitochondrialDNAmultipledeletionsbetweenth

8、easthenospermiaspermandnormalsperm．3、DiscussiontherelationshipbetweenmitochondrialDNAmultipledeletionandasthenospermia．Methods1、AccordingtotheresultsofpaIllolo