原位杂交技术及其在水产养殖动物病毒性疾病诊断中的应用

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1、一7l一中国动物检疫2010年第27卷第3期lIl持人：袁丽萍yp652@h。mi．。。m原位杂交技术及其在水产养殖动物病毒性疾病诊断中的应用蔡玉勇’，任伟成，王崇明29于佐安。，李贺(1．中国海洋大学，山东青岛266003；2．中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛266071；3．辽宁省海洋水产研究所，辽宁大连116023)摘要：本文介绍了原位杂交技术的发展概况、基本原理和应用价值，并概述了原位杂交技术在水产养殖动物(包括鱼、虾、贝类)病毒性疾病的检测、定位和体内表达模式等方面的应用。此外，还对该技术的应用前景进行了展望。关键词：原位杂交；地高辛标记；水产养殖；检测中图分类号：S94

2、；0527文献标识码：A文章编号：1005—944X(2010)O3一OO71—03原位杂交技术(insituhy—定位。1987年BoeringerMannhemBiering等0利用原位杂交检测bridizationISH)作为一种有效的Biochemisca将地高辛标记的有关试人工感染传染性胰脏坏死症病毒核酸杂交技术，使组织病理学的研究剂及药盒投放市场，相比放射性标记(IPNv)大西洋比目鱼卵黄囊幼虫，结从器官、组织和细胞水平走向分子水物，地高辛较放射性标记系统安全，果表明在幼虫肠、肝脏和肾脏均有病平。原位杂交技术灵敏度高、特异性方便、省时间。同时在敏感性和质量毒存在，靶位点在感染细胞

3、的细胞质强、检测快速，不但可以对检测样品控制方面比生物素标记技术要优越，内。Comps等利用标记狼鲈神经坏进行病毒或细菌的定性检测又可进同时有较好的反差背景，更有利于与死病毒(DIEV)片段的放射性探针和行定位检测，还可进一步检测病毒或免疫组织化学相结合，而且可以检测地高辛探针分别检测三种不同的鱼，细菌在寄主体内的表达模式。现已广基因表达。Haase等首先采用PCR两种探针均可以与DIEV和尖吻鲈脑泛应用于细胞或组织的基因表达、染和原位杂交相结合的方法检测了羊炎病毒(LcEV)核酸杂交，但不能与双色体分析、病毒诊断和发育生物学等绒毛膜络丛细胞中的绵羊脱髓鞘性RNA病毒科(Birnavirid

4、ae)和小核糖方面。脑炎病毒，建立了原位PCR(InSitu核酸病毒科(Picornaviridae)病毒1原位杂交技术的发展PCR，ISPCR)技术，能在组织细胞原位核酸杂交。陈晓艳等[5]通过注射神经Gal1和Pardue[1利用同位素标检出低拷贝的特异性基因序列，甚至坏死病毒(0GNNv)提取液人工感染斜记的爪蟾核糖体基因探针与其卵母能检出仅有1个拷贝的基因序列。带石斑鱼，解剖感染病毒的斜带石斑细胞杂交，确定该基因定位于卵母细2原位杂交技术原理鱼，从中分离出脑和眼睛，利用原位胞的核仁中，创立了原位杂交技术。原位杂交主要是利用碱基互补杂交技术检测组织中的斜带石斑鱼Orth应用H。标记的兔

5、乳头状瘤病毒原理，将体外合成并已标记的核酸探0GNNV。Huang等嘲应用原位杂交技术cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻针与组织活细胞中的特定核酸发生检测自然感染新加坡石斑鱼虹彩病切片进行杂交，首次用原位杂交技术杂交，从而将探针定位在特定核酸的毒(SGIV)的点带石斑鱼的靶位点及定位病毒DNA在细胞中的靶位点。但表达区域内。原位杂交所用的探针有其敏感性，其中肾脏和脾脏组织的信由于同位素标记的探针使用时间受RNA探针、eDNA探针和DNA探针，可号最强，肠和肝脏组织的信号相对较半衰期的限制，而且其放射性对人体以是双链DNA探针也可以是单链cR—强，胃和腮组织的信号最弱。在所有有害并污染环境，限

6、制了其发展。NA探针；核酸探针根据标记物的不检测组织中，阳性信号均特异性的定Bauman等首先应用荧光素标记cRNA同，又可分为放射性探针和非放射性位在上皮、内皮和内皮下肥大细胞探针做原位杂交。Shroyer用2，4二探针两大类。上。Chao等啪利用原位杂交技术检测硝基苯甲醛(DNP)标记DNA探针，使3原位杂交技术应用人工感染台湾石斑鱼虹彩病毒该DNA探针具有抗原性，探针与兔抗原位杂交技术现已广泛应用于(TGIv)的石斑鱼，发现只有在嗜碱性DNP的酶标抗体结合，经免疫过氧化各个领域，在医学方面多用于：诊断细胞中有标记阳性信号存在，嗜酸性物酶组织化学的方法显示杂交信号。感染性病原体；研究病毒

7、感染或致癌细胞和其他组织细胞都显示为阴性，Brigat利用生物素标记核酸探针，通原与恶性肿瘤之间的关系；产前产后结果与HE染色结果一致。实时监测过生物素与抗生物素结合，在组织切诊断基因相关疾病及在单个细胞确结果表明感染前期(60h以前)病毒片上由过氧化物酶一抗过氧化物酶定性别。荧光原位杂交在基因定位、DNA只在细胞核内表达，感染后期在显示系统显示病毒DNA在细胞中的染色体结构分析和图谱构建等方面感染细胞的细胞