对虾白斑综合症病毒(wssv)膜蛋白vp52b鉴定和功能的研究及极早期基因启动子筛选

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1、国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文摘要对虾自斑综合症病毒(WSSV)是危害养殖对虾的主要病原，致病能力强，传播范围广，给世界对虾养殖业造成了巨大的损失，至今依然没有有效的防治方法。本文围绕病毒膜蛋白开展研究，此外，还对病毒的极早期基因启动子进行了初步的筛选鉴定。研究工作主要包括以下几个方面：(1)本文对WSSV膜蛋白VP52B进行了鉴定和功能分析。该蛋白是病毒基因wsv256的编码产物。在EcoliBL．21菌株中表达了GST-VP52B，并制备了相应的抗血清。GSTpull．down分析发现V

2、P52B能与另一个病毒膜蛋白VP26相互作用。之前的研究认为VP26是重要的连接蛋白，为了确定该蛋白与VP52B的结合位点，表达了不同长度的VP26突变体，并发现VP26和VP52B相互作用的位点位于VP26135．170Aa。(2)通过超声法将WSSV基因组随机断裂至400—900bpDNA片段，并插入PIZAIE／V5．EGFP载体以构建文库，转染昆虫细胞Hi5后，发现其中部分细胞有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达，说明这部分细胞中的DNA片段可能具有极早期启动子活性。这对于进一步筛选和鉴

3、定WSSV极早期基因及开展极早期启动子研究具有重要意义。(3)从WSSV基因组中选择了20多个有锌指结构域或其他转录调控相关结构域的基因，克隆其上游400～500bp的启动子序列，连接到检测启动子活性的载体中。转染昆虫细胞Hi5发现有两个ORF(ORF249、ORF403)上游序列具有较强的启动子活性。这两个ORF序列分析发现，它们都具有Ring．H2fingermotif，因此推测这种结构特点与WSSV极早期基因启动子活性相关。关键词：VP52B：启动子；极早期基因国家海洋局第三海洋研究所硕士学

4、位论文AbstractWhitespotsyndromevirus(wssv)isthemainpathogenofshrimp．Thisthesisfocusesonviralenvelopeproteins．Also，weconcemaboutthescreeningandidentificationofWSSVimmediate-earlygenes．Theworkmainlyincludesthreepartsbelow：(1)Wecharacterizedandinvestigatedt

5、hefunctionalityofWSSVenvelopeproteinVP52B(ORFwsv256)．TheORFwsv256wasclonedandexpressedinEcoliBL-21witllGST-tagandpolyclonalantibodyofVP52BWaspreparedafterwards．GSTpull-downsuggeststhatVP52Binteracts晰thVP26，amajor讥ralenvelopeproteinwhichhadbeenreported

6、asacruciallinkingelement．ForthepurposeoffindingoutthespecificinteractingregionsofVP26withVP52B，sixmutationsofVP26wereconstructedandexpressed．The135—170AaregionofVP26foundouttoplayanimportantroleOlltheinteractionofVP26andVP52B．(2)WSSVgenomewasrandomlyf

7、ragmentedto400bp一900bpusingultrasonicprocessandtheninsertedtovectorPIZAIE／V5·-EGFP·-Histobuildalibrary．AftertransfectingHi5insectcellswiththislibrary，apartofthecellsprovedtoexpressenhancedgreenfluorescentprotein，suggestingDNAfragmentsinthesecellsmight

8、functionasimmediate-earlygenepromoters．ThereforeourstudywouldbehelpfulforthescreeningandidentificationofWSSVimmediate·earlygenesandimmediate—earlygenepromoterstudies．(3)TwentyWSSVORFs，including’’zincfingerstructureorothertranscriptregulatingfa