中国对虾整合素β亚基与对虾白斑症病毒(wssv)感染的相互关系研究

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1、谨以此论文献给所有关心、支持和帮助过我的亲人、师长和朋友！————钟汝杰中国对虾整合素β亚基与对虾白斑症病毒（WSSV）感染的相互关系研究学位论文答辩日期：指导教师签字：答辩委员会成员签字：独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢

2、意。学位论文作者签名：签字日期：年月日---------------------------------------------------------------------学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下事项：1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编

3、入CNKI《中国知识资源总库》，授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签字：签字日期：年月日签字日期：年月日中国对虾整合素β亚基与对虾白斑症病毒（WSSV）感染的相互关系研究摘要整合素是一类由αβ亚基组成的异二聚体细胞黏附分子，主要介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的相互黏附，参与细胞与细胞外基质之间的双向信号传导。整合素广泛分布于细胞表面并被证实为大量病毒的受体或共受体，它的大多数配体分子通过特征性的RGD（Arg-Gly-Asp）

4、模体与之结合。对虾白斑症病毒（WSSV）病是危害中国对虾养殖业健康发展的主要疾病之一，前期研究表明WSSV多个含有RGD模体的囊膜蛋白与WSSV的感染相关。因此，整合素可能是WSSV潜在的受体蛋白。为了阐明整合素在WSSV感染过程中的潜在作用，探讨整合素和WSSV的相互关系，本论文利用抗中国对虾整合素β亚基（FcβInt）单克隆抗体2C5，结合ELISA和流式细胞术跟踪检测了中国对虾在感染白斑症病毒（WSSV）后血细胞中的FcβInt表达变化情况，流式细胞术结果显示颗粒与半颗粒血细胞上的FcβInt分布丰度显著高于透明细胞，且在

5、感染WSSV后这两种血细胞上的FcβInt丰度发生显著上调，在12h时达到最高值，而透明细胞上的FcβInt丰度未发生显著变化；ELISA结果显示总血细胞中的FcβInt蛋白含量在感染WSSV后同样出现显著上调，在12h时达到最高值；荧光定量PCR检测结果显示中国对虾在感染WSSV后总血细胞中的FcβInt转录水平发生显著上调，且在12h时达到最高值，而血细胞中的WSSV基因组拷贝数则在24h时发生显著升高。同时，对WSSV六个囊膜蛋白进行原核重组表达，VOPBA和Dotblotting检测结果显示VP37、VP110、VP18

6、7及重组VP31均具有FcβInt结合活性，而VP26和VP28不具有FcβInt结合活性；阻断ELISA和Dotblotting检测结果显示FcβInt混合单抗（2C5和2C10）对对虾血细胞与WSSV相互结合作用具有一定阻断效果。论文研究结果为论证FcβInt作为WSSV潜在细胞受体提供了数据支撑。具体研究内容和结果如下：（1）抽提中国对虾血细胞总RNA，根据FcβInt的全长基因序列设计引物，克隆FcβIntVWA结构域基因片段，构建了FcβIntVWA结构域融合表达载体pET32a-FcβInt-VWA，转入大肠杆菌后成

7、功表达，应用镍离子螯合亲和层析纯化重组蛋白，最终获得了分子量大小为50kDa的重组蛋白rFcβInt-VWA。（2）Westernblotting分析两株杂交瘤细胞株2C5和2C10分泌小鼠抗FcβInt抗体的类型，两株单抗均属于IgM类；将两株杂交瘤细胞株扩大培养，并腹腔注射BALB/c小鼠制备抗FcβInt腹水单抗，并利用优球蛋白沉淀法结合凝胶过滤法进行纯化，纯化后的单抗经SDS-PAGE分析，纯度较高；间接ELISA实验测得腹水单抗2C5和2C10的效价分别为1:6400和1:12800；斑点免疫印迹实验显示，两株单抗特异

8、性地与rFcβInt-VWA结合；间接免疫荧光实验和Westernblotting表明单抗2C5能特异性识别一条分子量为120kDa左右中国对虾血细胞蛋白，推测其为FcβInt。通过对单抗的抗体类型、效价和特异性进行分析，选择抗体类型是IgM类、效价高、特异性好