硫氧还原蛋白与肿瘤蛋白在wssv感染中作用及凡纳滨对虾感染wssv后代谢物的变化

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1、分类号密级UDC编号硕士学位论文硫氧还原蛋白与肿瘤蛋白在WSSV感染中作用及凡纳滨对虾感染WSSV后代谢物的变化刘鹏飞（1219002）指导教师姓名吴垠教授专业名称生理学论文答辩日期2015年6月2日学位授予日期年月MASTERDISSERTATIONTheFunctionofThioredoxinandOncoproteininWSSVinfectionandmetabolitechangingafterinfectedbyWSSVinLitopenaeusvannameiSupervisors：Prof.WuYinMaste

2、rcandidate：LiuPengfeiStudentnumber：1219002COLLEGEOFFISHERIESANDLIFESCIENCE,DALIANOCEANUNIVERSITY,DALIAN,LIAONING,P.R.CHINAJUNE2015摘要摘要白斑综合征病毒（WSSV）是一个严重影响对虾养殖业的病毒，它于1992年首先发现于东南亚地区，此后相继在世界范围内传播开来。由于其可以侵染的宿主范围非常广泛，所以每年都会给对虾养殖业带来巨大的经济损失。该病毒可以侵入多种宿主，包括多种水产动物，如对虾、蟹、淡水虾和小

3、龙虾、以及水生节肢动物和浮游动物[5-6]。本实验拟通过分子生物学以及蛋白质组学的一些方法，来研究硫氧还原蛋白Thiordoxin（TRX）和肿瘤蛋白onoprotein（OP）与WSSV的作用情况，并通过1HNMR核磁共振光谱分析法分析感染了WSSV的凡纳滨对虾代谢产物的变化情况，以及TRX、LvP38、CAT和POD四种基因在凡纳滨对虾感染了WSSV后的变化情况，从而来进一步的探讨WSSV的治病机理[1-4]。Part1：硫氧还原蛋白Thiordoxin（TRX），是一个重要的细胞内抗氧化蛋白，它具有一系列生物学功能。有研究

4、表明，TRX的基因表达量在感染WSSV的动物体内呈上升趋势。然而，TRX在WSSV感染中的作用及对相关信号通路的影响尚不清楚。序列分析表明，TRX可以与WSSV上的结构蛋白WSSV030（VP362）和WSSV454（TK-TMK）相互作用。本部分通过原核表达成功获得TRX、VP362和TK，并用Farwesternblot和ELISA方法证明他们之间确实可以相互作用。通过绝对定量以及相对定量的分析表明，TRX蛋白的过表达可促进IKK、LvP38和STAT这些免疫相关的基因和细胞信号通路的相关基因在感染WSSV对虾体内的基因表达

5、量，并且在WSSV感染对虾体内，TRX基因与VP28基因的相对表达量呈正相关。体外中和试验表明TRX在对虾体内过表达后，可加快WSSV在对虾体内的复制，并加快感染WSSV的对虾的死亡，说明TRX具有促进WSSV感染的作用。Part2：本部分实验主要研究肿瘤蛋白（oncoprotein）OP（与NDK序列相同）与WSSV的作用关系。首先通过原核表达获得OP表达产物，亲和层析纯化出OP蛋白。采用Farwesternblot和ELISA方法研究OP与WSSV结构蛋白的作用，结果表明OP与WSSV膜蛋白VP28有相互作用。然后再通过体外

6、注射OP蛋白于凡纳滨对虾体内，测量病毒拷贝数以及mRNA水平上IE1和VP28基因的相对表达量，结果表明OP蛋白可促使WSSV在对虾体内的复制，并促使WSSV感染的对虾体内的IE1和VP28基因表达量升高。体内中和试验表明，注射OP蛋白的感染WSSV的对虾，死亡时间早于其他实验对照组。RNA干扰实验表明，注射dsRNA-OP的感染组对虾，死亡时间明显延后于正常感染WSSV的对虾和其他实验对照组。由此推断，OP蛋白可以加快WSSV在对虾体内的增殖，且OP蛋白可能是一种WSSV促死蛋白。Part3：本部分实验通过1HNMR光谱分析法

7、分析感染WSSV的凡纳滨对虾和健康的对虾的代谢差异。实验内容主要是各取WSSV感染48h后的对虾和注射PBS缓冲液48h后的健康对虾的肝胰腺组织进行NMR和多元数据分析（包括主成分分析PCA，正交偏最小二乘分析模型OPLS-DAmodle），发现与健康对虾相比，WSSV感染的对虾的肝胰腺组I摘要织中，醋酸盐、脂质（-CH2-CH=CH-）、赖氨酸、酪氨酸、N-乙酰基糖蛋白的含量很低，而α-葡萄糖和β-葡萄糖的含量则非常高，这表明WSSV感染干扰了对虾对氨基酸的吸收，蛋白代谢以利于病毒复制。本研究结果有助于深入了解病毒致病机制。P

8、art4：为比较凡纳滨对虾与氧化反应和信号转导相关基因在WSSV感染中的变化情况，本部分实验采用实时荧光定量PCR的技术分析白斑综合征病毒（WSSV）感染凡纳滨对虾6、12、24、48、72五个时间段后鳃和类淋巴组织中硫氧还原蛋白（TRx）、p38信号通路（Lv