masp-2 egf和sp功能区抗体制备及初步鉴定

《masp-2 egf和sp功能区抗体制备及初步鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号：单位代码：10092密级：学号：20101023MASP一2EGF和SP功能区抗体制备及初步鉴定单位：专业：研究生姓名：河北北方学院医学检验学院病原生物学周芳导师姓名及职称：贾天军教授研究起止日期：2012．4．2013．4提交日期：2013．5河北北方学院学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河：It：ll：方学院所有。河北北方学院有权对本学位论文进行交流、公开和使用。导师签名：研究生签名：研究生学位论文

2、独创性声明2013年5月30日本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。导师签名：埒研究生签名：同步2013年5月30日目录中文摘要·．oo·-．ooll-J

3、．I·⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·3英文缩写⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6研究论文MASP．2EGF和SP功能区抗体制

4、备及初步鉴定前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·8羁n舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯’芍实验仪器与材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10实验方法和步骤⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“⋯⋯⋯14结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·．47结论⋯⋯⋯⋯⋯“⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··50参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51综述MASPs的研究现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·57致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯73个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯74中文摘要MASP-2EGF和SP功能区抗体制备及初步鉴定摘要近年来，关于天然免疫识别学说一模式识别理论的提出推动了免疫学的发展。模式识别受体．病原体相关分子模式(pattern

6、recognitionreceptor．pathogenassociatedmoleculepattern，VRR-VAMV)的研究引起高度关注。甘露聚糖结合凝集素(mannose—bindinglectin，MBL)是重要的PRR之一，在固有免疫中扮演重要角色。当MBL识别病原体时，其下游的蛋白酶MASP．2(mannose．bindinglectinassociatedserineprotease．2)通过裂解丝氨酸蛋白酶域N端的精氨酸．异亮氨酸问的肽键发生自激活作用，在补体激活的凝集素途径中发挥重要作

7、用。另有研究表明，MASP一2与肿瘤，感染性疾病和自身免疫性疾病有关。因此，对MASP．2的研究已成为研究天然免疫的热点之一。MASP一2由6个功能区组成，其rOEGF功能区含Ca+结合模体，SP功能区具有较高的激活凝血酶能力，参与MASP．2的自激活。本课题拟在构建构建MASP．2EGF和SP原核表达载体重组质粒的基础上，在异丙基硫代半乳糖苷的作用下进一步诱导表达蛋白，纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体，以期为为后续检测体液MASP一2含量、分析不同细胞MASP一2表达情况奠定基础。首先从胎肝提取总RNA，反转

8、录合成cDNA后以此为模板，应用PCR技术扩增得到特异性EGF、SP基因，采用酚一氯仿抽提法提纯PCR产物，对EGF、sP片段和pGEX-6p．2质粒进行BamHI、NotI双酶切，凝胶回收各片段，以T4DNA连接酶分别连接EGF和sP片段酶切产物与pGEX．6P．2载体构建重组质粒。采用热休克法分别将EGF、SP重组质粒转化导A。E．coliBL21感受态细菌，转化后菌液直接涂布于LB固体选择培养基培养过夜。采用针对pGEX．6p一2质粒通用引物的菌落PCR初筛LB平板上生长的单克隆菌落，将阳性扩增的单克

9、隆接种于LB液体选择培养液震荡培养过夜，提取质粒为模板，以载体通用引物分别和EGF、sP目的片段的特异引物进行cross．PCR鉴定，并同时进行砌mHI、NotI双酶切鉴定。Cross—PCR扩增阳性和双酶切鉴定均正确的质粒进行DNA中文摘要序列测定鉴定重组质粒正确性。序列测定结果与GenBank公布的masp一2EGF和SP标准序列比对完全一致，且没有发现移码现象，说明成功构建pGEX⋯6P2EGF、pGEX．