抗菌肽cec-nis-lfm的串联表达及对鸡肠炎沙门氏菌抑菌机理初步研究

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1、分类号UDC密级编号硕士学位论文抗菌肽Cec-Nis-Lfm的串联表达及对鸡肠炎沙门氏菌抑菌机理初步研究TandemExpressionofAntibacterialPeptideCec-Nis-LfmandthePreliminaryStudyonAntibacterialMechanismofSalmonellaenteritidis学位申请人：万鹏指导教师：牛明福副教授一级学科：生物学二级学科：生物化学与分子生物学学位类别：理学硕士2016年04月万方数据独创性声明本人声明，所呈交的论文是我个人在导师指导下完成的研究工作及取得的研究成果。据我所知，文中除了特别加以

2、标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河南科技大学或其它教育机构的其他学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：日期：关于论文使用授权的说明本人完全了解河南科技大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校拥有对所有学位论文的复制权、传播权、汇编权及其它使用权（特殊情况需要保密的论文应提前说明，但在解密后应遵守此规定）。需要保密的论文请填写：本学位论文在年月至年月期间需要保密，解密后适用本授权书。（需要保密的学位论文无须向图书馆提供论文的电子文档）研究生签名：导师

3、签名：日期：万方数据摘要摘要随着抗生素药物和化学防腐剂的大量使用，细菌耐药性及防腐剂在食品中残留等问题越来越引起人们的关注。近年来研究开发不易产生耐药性抗菌药物和天然防腐剂成为研究热点之一。研究表明，抗菌肽具有高效的抗菌活性及独特的抗菌机制，不易产生耐药性，而且还具分子量小、安全无毒、水溶性好、热稳定性好、抗真菌、病毒以及抗肿瘤等特点，引起了国内外研究者的广泛关注。因此，抗菌肽成为最具开发前景的抗生素替代品和新型安全食品防腐剂。本研究将几种不同来源的抗菌串联表达，作为复合抗菌肽研究其生物活性及抑菌机理，根据Genbank中Cecropin、Nisin、LfcinB和Ma

4、gaininⅡ抗菌肽序列，选取LfcinB和MagaininⅡ的核心功能序列，组合成新型抗菌肽Lfm。用酵母的Kex2酶裂解位点识别序列（GAGAAAAGA）将Cecropin、Nisin和Lfm的核苷酸序列串联起来，并在两端插入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点识别序列、保护碱基和终止密码子，选取毕赤酵母基因翻译偏好密码子，人工设计合成复合抗菌肽Cec-Nis-Lfm基因，克隆到真核表达载体pPICZαA中构建重组表达载体pPICZαA-CNL，双切鉴定后的重组载体经SacⅠ线性化后电转入毕赤酵母X-33、GS115和SMD1168中，经Zeocin抗性筛选、PCR鉴定以及测

5、序鉴定筛选高拷贝阳性转化子，用甲醇诱导表达，表达产物经Tricine-SDS-PAGE电泳检测，SMD1168在预期位置出现相应的特异条带，对目的条带进行LC-MS/MS胶条鉴定，三种抗菌肽均被检测到，用BCA蛋白浓度试剂盒检测抗菌肽浓度为493.36μg/mL。用牛津杯法检测抗菌肽CNL对鸡肠炎沙门氏菌（Salmonellaenteritidis）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）以及痢疾志贺氏菌（Shigelladysenteriae）的抑菌活性，均出现明显的抑菌圈，对鸡肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和痢疾志贺氏菌的抑菌圈平均直径为36.97

6、mm、30.21mm和31.53mm；MIC为10.32μg/mL、12.88μg/mL和15.44μg/mL。为研究其抑菌机理，对抗菌肽CNL处理鸡肠炎沙门氏菌上清液进行琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE电泳，发现随着处理时间的增加，上清液中DNA的含量以及蛋白质组成均发生变化，初步验证了抗菌肽CNL作用于细胞膜。用场发射扫描电镜观察经抗菌肽CNL处理过的鸡肠炎沙门氏菌细胞膜，与对照组相比，随着处理时间增加，细胞膜皱褶更加明显，细胞有内容物流出的现象，充分说明抗菌肽CNL作用于细胞膜导致菌体裂解死亡。本研究为设计合成抗菌肽CNL在毕赤酵母中的表达、抗菌肽的临床应用、I万

7、方数据摘要抑菌机理研究以及食品防腐应用提供理论依据和参考。关键词：串联表达；抗菌肽；毕赤酵母；抑菌机理；扫描电镜论文类型：应用基础型选题来源：横向项目“免疫活性肽的基因工程表达”、“复合抗菌肽的酵母表达及高密度培养发酵”II万方数据ABSTRACTABSTRACTWiththeextensiveuseofantibioticsandchemicalpreservatives,theproblemofbacterialresistanceandtheresidueinfoodhasattractedmoreandmoreattention.