生化实验复习

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1、—、离心技术1.概念:根据物质的质量、沉降系数及浮力因素等不同，应用高速旋转产生强大的离心力，使物质分离、浓缩、提纯的方法称为离心(centrifugation)技术。2.离心的基本术语①离心力(F)：在一定角速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力。F=co2r(3是旋转角速度，以弧度/秒为单位；r是离心转子的半径，以cm为单位)②相对离心力(RCF)：离心力转化为重力加速度(g)的倍数。RCF=o2r/g=(1.119X10-5)n2rn为转子每分钟的转数(rpm)一般情况下，低速离心时常以转速“rpm”来表示，髙速离心时则以“

2、g”表示。③沉降系数(S)：颗粒在单位离心力作用下粒子移动的速度。S的物理意义是颗粒在离心力作用下从静止状态到达等速运动所经过的吋间，单位为秒。S在实际应用屮常在10-13秒左右,即10-13S为ISo文献屮常用沉降系数以描述某些生物大分子或亚细胞器大小。3.离心机分类(1)普通离心机：最大转速6000rpm左右，分离形式是固液沉降分离，转子有角式和外摆式，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。(2)高速冷冻离心机：最大转速为20000〜25000rpm,分离形式是固液沉降分离

3、，一般都有制冷系统，通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫镀沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。(3)超速离心机：转速可达50000〜80000rpm,分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，离心管平衡允许的误差要小于0.1克。超速离心机的出现，使生物科学的研究领域有了新的扩展，它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器得到分级分离，还可以分离亚细胞器、病毒、核酸、蛋白质和多糖等。4.离心管的选用离心管主要用玻璃、塑料和不锈钢制成(1)玻璃离心管绝对不能在高、超速离心机上使用。(

4、2)塑料离心管常用材料有聚乙烯(PE),聚碳酸酯(PC),聚丙烯(PP)等，其中PP管性能较好。具体如下：A、PA管：化学性能稳定，半透明，能耐高温消毒。B、PP管：化学性能稳定，半透明，能耐高温消毒。C、PC管：透明度好，硬度大，能耐高温消毒。但不耐强酸强碱及某些有机溶剂。主要用于5万(转/分)以上离心。D、CN管：质地较软，透明，但不耐强酸强碱及某些有机溶剂，不能高压消毒。适合于蔗糖、廿油等密度梯度离心。因透明，利于收集。(3)不锈钢离心管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。5

5、.离心机的使用注意事项(1)离心机要置水平位置，以保证旋转轴与地面水平面垂直。保持良好的通风环境，避免阳光和热源直接照射。(2)使用前应检查离心机转头转速，不得过速使用。禁止离心机不加转子空转且确认转子己放稳，一定要选择适宜的转子。(3)样品倾入离心杯后应与离心管套一起两两平衡(台称)，平衡后把它们放置于转子的对称位置，严禁装载奇数的离心管。严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。(4)离心机工作前一定要检查离心机盖是否盖严，之后打开电源开关，调整离心时间。(5)启动离心时转速应由小至大，缓慢升速，达到预定转速后再调整离心时间至预定时间。(6

6、)在使用过程屮，若发现声音不正常，应立即停机。(7)离心结束，要等到转速为零时才能打开离心机盖，取出样品。调整调速旋钮至零位，同时关闭电源。（8）每次使用后，要仔细检查转头，及时清洗、擦干。长期不使用，应将转子取下擦拭涂油并妥善保管。二、光谱技术（分光光度技术）1.分光光度法的概念:利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计。2.常用光谱分析术语①光吸收：当一定波长的光通过某介质吋，该介质有选择地吸收某一波长的光，使入

7、射光的强度减弱，这种现象称为光吸收。②吸光度（A）（absorbance）：又称光密度（OD）或消光度（E）,表示光被吸收的量度。它与被测溶液的浓度（C）,液层的厚度（L）成正比，消光度越高，溶液对光吸收的程度越大。③透光度（T）（transmittance）表示光线透过的量度。通常以百分数表示。④消光系数（£）：是溶液对光吸收的比例常数，消光系数的物理意义是吸光物质在单位浓度以及单位厚度时的吸光度值，用£表示。£值取决于溶质性质、入射光波长和温度。£越大，吸收光的能力越强，相应的分光光度法测定的灵敏度就越髙。4•分光光度计种类（1）可见分

8、光光度计：在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收，但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定，故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且