生化实验复习资料

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1、名词解释凝胶等电聚焦电泳：在电场作用下，两性电解质载体在凝胶中移动，形成PH梯度，蛋白质在凝胶中迁移至其PI的PH处，即不再泳动而聚焦成带。离子交换层析：简称为IEC是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。SDS-PAGE：SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。透析与超滤:透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其

2、它小分子物质如无机盐单糖等分开。超滤是利用压力、抽滤或离心力等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐目的。亲和层析:亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。吸附层析:以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。凝胶过滤:凝胶层析，又称为凝胶过滤、分子排阻层析或分子筛层析。是以各种凝胶为固定相，

3、利用流动相中所含各物质的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。Rf值:溶质在滤纸上移动的速率Rf=a/b式中a：溶质斑点中心的移动距离b：溶剂前沿移动的距离分配系数:K=固定相中溶质的浓度/流动相中溶质的浓度是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值问答题问答题1、试设计利用离子交换剂分离一种含等电点分别为4.0、6.0、7.5和9.0蛋白质混合液的方案，并简述理由。答：先用PH为6。8的缓冲液平衡阴性离子交换剂，再用这种缓冲液来洗脱蛋白质，则等电点为4。0和6。0的蛋白质会被离子交换剂吸附，等电点为7。5和9。0的蛋白质就会被洗脱下

4、来。再用离子强度小的洗脱液来洗脱，使等电点为6。0的蛋白质被洗脱下来，再增大洗脱液的离子强度使等电点为4。0的蛋白质也被洗脱下来。分离等电点为7。5和9。0的蛋白质：用PH为8。0的缓冲液来平衡阴性离子交换剂，再用这种缓冲液来洗脱蛋白质，则等电点为7。5的蛋白质会被离子交换剂吸附，等电点为9。0的就会被洗脱下来，再用离子强度小的洗脱液把等电点为7。5的蛋白质洗下来。2、试述柱层析时柱的安装、上样方法以及注意事项。湿装法系先加适量溶剂到柱内，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/3时打开柱下端口，让溶剂慢慢

5、流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。这种装柱法对各种基质都适用。装好的层析柱应立即与洗脱剂连接，在一定的操作压下(贮液器内液面与层析柱出口之间的压力差)，控制其流速，让2-3倍柱体积的洗脱剂流过固定相，使其达到平衡，也使固定相高度恒定或离子强度与洗脱剂一致。此时层析柱中基质应合乎填装均匀、松紧一致和没有气泡的标准。加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2。待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂(其体积用液面距固定相表面的高度约5厘米计)，并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始冼脱。注意事项：为了获得满意的分离结果，洗脱液的流速务必恰当控制。如果太快，洗脱物在两相

6、中的平衡过程不完全；如果太慢，洗脱物会扩散。若峰与峰之间有重叠，宜降低洗脱剂的强度，若峰间距离过大，或某些成分不能洗脱时，宜加大洗脱剂的强度(极性)，成分复杂时，可采用洗脱剂由弱到强的梯度洗脱(方法见离子交换层析)。由层析柱分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定。如杂质含量仍大时，应该用其它方法继续纯化。1、试述离子交换剂与缓冲液的选择。答：离子交换剂的选择：(1).阴、阳离子交换剂的选择如果被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；如果被分离物质带负电荷，则应选择阴离子交换剂；如果被分离物质为两性离子，要按照其稳定状态的净电荷来选择交换剂。假设一蛋白质的等电点为5，若该

7、物质在pH5-8稳定时，应选择阴离子交换剂；若该物质在pH5以下稳定时，则可选择阳离子交换剂。(2.)强、弱离子交换剂的选择一般来说，强离子交换剂适用的pH范围很广。所以常用它来制备无离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的物质。而弱性离子交换剂适用的pH范围较窄，在pH为中性的溶液中交换容量也高，用于分离生物大分子物质时，其活性不易丧失。所以，分离生物样品多采用弱离子交换剂。(3).反离子的选择离子交换剂处于电中性时往往带有一定的反离子。阳离子交换剂的反离子H+(H型)、Na+（Na