gx-50对阿尔茨海默病的作用及其机理研究

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1、申请上海交通大学博士学位论文gx-50对阿尔茨海默病的作用及其机理研究博士生：唐茂萍学号：0100809029指导教师：乔中东教授专业：生物学研究方向：细胞生物学学院：生命科学技术学院上海交通大学二〇一三年六月万方数据ADissertationSubmittedtoShanghaiJiaoTongUniversityfortheDegreeofPhilosophyDoctorFUNCTIONANDMECHANISMOFgx-50ONALZHEIMER’SDISEASEAuthor:MaopingTangStudentNo.:0100809029Supervisor:P

2、rof.ZhongdongQiaoMajor:BiologyInstitute:SchoolofLifeSciences&BiotechnologyShanghaiJiaoTongUniversity2013.06万方数据万方数据万方数据gx-50对阿尔茨海默病的作用及其机理研究摘要阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是一种中枢神经系统退行性疾病，临床上的主要病理特征是β淀粉样蛋白在细胞外沉积形成老年斑和tau蛋白过度磷酸化在细胞内形成神经纤维缠结，主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍等。针对AD的发病机制，已经研究了很多对其治疗的药物，但是由

3、于其病因的复杂性，目前仍然没有有效的方法逆转和阻止病情进展，我们利用结构生物信息学工具设计了一种药物，希望可以有效地防治AD的发生。研究目的：N-[2-(3,4-dimethoxyphenyl)ethyl]-3-phenyl-acrylamide(gx-50)是存在于花椒中的一种天然化合物，根据生物信息学的理论可以推断出gx-50可以对AD有一定的治疗作用。为了验证这一理论，我们设计了一系列与药物研究相关的体内体外生物学实验，根据所获得的实验数据来判断gx-50是否可以有效地、安全地防治AD；除此之外，在验证gx-50对AD的发生有一定疗效之后，我们进一步设计生物学实

4、验来初步探索gx-50在干预AD过程中所涉及到的细胞分子机制。研究方法：对大鼠口服gx-50(20mg/kg)后，在不同时间点收集大鼠的各个组I万方数据织器官，采用代谢动力学方法研究gx-50在机体内各组织的代谢情况；之后对东莨菪碱痴呆小鼠模型和转基因痴呆小鼠腹腔注射gx-50(1mg/kg)，采用Morris水迷宫动物行为学实验验证gx-50改善痴呆小鼠记忆力的能力；在完成水迷宫实验之后，将转基因小鼠灌流取出大脑组织，采用UPLC/Q-TOF-MS方法检测gx-50在转基因小鼠大脑中的蓄积情况。针对AD的病理特征之一淀粉样蛋白斑块进行实验。对完成Morris水迷宫实

5、验的转基因小鼠大脑皮层中淀粉样蛋白斑块进行免疫组化分析，证明gx-50对斑块沉积的影响；另一方面，利用原子力显微镜观察gx-50和淀粉样蛋白寡聚体在37℃共孵育48h之后，淀粉样蛋白聚集体的空间结构变化，以此推断gx-50是否可以直接与淀粉样蛋白寡聚体相互作用。将体外培养的神经元用Fluo-4钙染料共染后，利用激光共聚焦扫描2+显微镜观察gx-50和淀粉样蛋白对胞内Ca水平的影响；另一方面，将体外培养的神经元用gx-50(1µM)和Aβ25(25µM)处理24h，用TRIzol将其收集起来，进行基因芯片分析，筛选出351个与AD密切相关并在芯片数据中表现出显著性差异的

6、基因，用Genespring软件、Blast2GO软件对这些基因数据进行统计归类，探索gx-50干扰AD发生过程中所涉及到的分子以及信号通路。筛选出Akt1、Apoe、App、Bdnf、Creb、Gsk3b、Ncstn和Psen18个与AD发生密切相关的基因，设计引物进行实时定量PCR分析，并且借此验证基因芯片数据的有效性；为了探索gx-50防治AD过程中所涉及到的分子机制，从体外培养的神经元和Morris水迷宫实验中的转基型和野生型小鼠的大脑组织中提取蛋白，利用Westernblot分析与突触的可II万方数据塑性和记忆形成相关的AKT、GSK和CREB及其磷酸化蛋白

7、在各处理组的表达变化；对Morris水迷宫实验中的转基型和野生型小鼠的大脑组织进行免疫组化分析，比较各组间磷酸化CREB的表达含量，以此推断gx-50对痴呆小鼠认知功能的影响。研究结果：通过代谢动力学实验发现gx-50被口服之后5min内即可被迅速吸收而后穿透血脑屏障进入大脑组织，同时在口服4h之后gx-50被肝脏代谢，被肾脏排除体外不会对机体造成副作用；Morris水迷宫实验中，东莨菪碱痴呆小鼠和APP转基因痴呆小鼠找到平台的潜伏期分别在70s、100s，随着训练次数的增加，潜伏期没有很大程度的缩减，而gx-50处理组小鼠随着训练次数的增加潜伏期越