（果树学专业论文）苹果属山定子mbnramp1基因克隆及其功能的初步研究

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1、苹果属山定子Mb．nrampl基因克隆及其功能的初步研究肖海华(中国农业大学园艺植物研究所，北京100094)摘要Nramp(NaturalResistance-AssociatedMacrophageProtein)是一个膜整合蛋白家族，该家族基因成员在金属离子的转运，尤其是在铁离子的代谢中起着重要的调控作用。本文以苹果属抗寒砧术山定子(Malusbaccata(L．)Borkh)为试材，根据植物中Nrampl基因的保守区域设计简并引物，采用RT-PCR与RACE法相结合，从苹果属山定子中克隆Nrampl基因，并在真核模式生物酵母中对该基因

2、功能进行了初步研究。主要结果如下：1．率先从苹果属山定子中克隆到一条长为2090bp的cDNA序列，该基因含有长为1656bp的开放阅读框，编码531个氨基酸。将所得序列在GenBank中进行同源性比较，结果表明该基因属于Nramp基因家族，而且与番茄中的Nrampl基因具有极高的同源性，将该基因命名为Mb．nrampl，基因登录号为AY724413。与植物中的同源基因进行序列比对，结果表明Mb．NRAMPl与LeNRAMPl具有很高的同源性，同源性为66％，相似性为80％；与OsNRAMPl的同源性为63％，相似性为68％；与AtNRAMP

3、l同源性为55％，相似性58％。Mb．NRAMPl蛋白含有推断的N一端相连的糖基化位点，12个推断的跨膜域fris)和在第八和九个跨膜域之间第四个胞内环中有一个一致的转运基序。2．山定子中该基因为单拷贝。正常供铁条件下，Mb．nrampl基因在根中转录水平极低，在叶片中几乎不表达。缺铁条件下，Mb．nrampl基因在根中转录水平迅速提高，直到缺铁15天时转录仍处于较高水平。然而，直到缺铁15时时叶片中表达仍然很微弱。3．Mb．nrampl基因转化酵母突变株DEYl453生长状况明显好于空载体转化后的突变株。培养基中BPDS增加到15uM时，转

4、化了Mb．nrampl的酵母细胞生长状况与野生型相差无几。在30pMBPDS时，Mb．nrampl转化的细胞与低浓度BPDS相比生长延缓，但是明显优于空载体转化的DEYl453突变株。与较低浓度BPDS相比，野生型酵母(DYl457)的生长量也减少了。初步证明m．nrampl编码具有功能的铁转运蛋白，转运蛋白Mb．NRAMPl能够使酵母吸收铁的突变株恢复突变。进一步在酵母细胞中对Mb．NRAMPl进行亚细胞定位研究，结果表明该蛋白主要位丁二细胞膜内侧的内吞泡膜上．还有--d,部分位于多聚小泡上。初步提出植物中存在第三种铁吸收机制．内吞机制，构

5、建了内吞机制模型。关键词：苹果属山定子：Mb．nrampl酵母突变株DEYl453i亚细胞定位IsolationandcharacterizationofMb．nramplgeneinMalusbaccata(L．)BorkhXiaoHaihua(InstituteforHorticultiralPlants，ChinaAgricultureUniversity，Beijing100094，China)AbstractGenemembersoftheNrampfamilyencodingofintegralmembraneproteins，a

6、xeinvolvedinmetaliontransportion，especiallyregulationofironmetabolism．InordertoisolatetheNramplgene(Natural‘resistance—associatedmacrophageproteinl)fromMalusbaccata(L)Borkh，RT-PCRusingdegenerateprimerscorrespondingtoconservedmotifsofNramplinplant，andcombinedwithRACE．Andafte

7、rthatfurtherstudyonfunctionandsubcellularlocalizationwasdevelopedinmodeleukaryon。’nemainresultsaxeasfollows：1．A2090bpeDNAfragmentwascloned，whichcontainsafull-lengthopenreadingflameofNramplgeneinMalusbaccata(L)Borlda．Itencodesapredictedpolypeptideof551aminoacidswithamolecula

8、rweightofabout59．仉【Da．BecausethisgenesharedhighhomologyofLenrampl．itisnominatedasM