daple基因在鼠脑内及体内的空间分布表达

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1、学校代码：10023学号：200501067Daple基因在鼠脑内及体内的空间分布表达专业年级：北京协和医学院临床医学专业05级姓名：王亭睿导师：王任直(教授)北京协和医学院临床学院(北京协和医院)神经外科完成日期：2013年6月㈣中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4S致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51独创性声明与学位论文版权使用授权书⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．S3缩略词表英文缩写英文全名中文全称ATPadenosinetriphosphate三磷酸腺菅cDNACTPDEPCDNADTTEDTAGTPPCRPBSRNAcomplementaryDNAcytidinetriphosphatediethylpyrocarbonatedeoxyribonucleicaciddithiothreitolethylenediaminetetraaceticacidguanosinetriphosphatepolymerase

3、chainreactionphosphatebufferedsalineribonucleicacid互补脱氧核糖核酸三磷酸胞苷焦碳酸二乙酯脱氧核糖核酸二硫苏糖醇乙二胺四乙酸三磷酸鸟苷多聚酶链式反应磷酸盐缓冲液核糖核酸3中文摘要研究目的：Daple又称为含有高亮氨酸残基的Dvl相关蛋白。Daple是Girdin家族的基因(Girdin，Daple，FLJ004354)。其中Daple和Girdin在N端有很大的同源性，(54％的氨基酸相同)，意味着两个基因功能相似，而C末端则与Girdin较少的相似性，只有27％，这意味着Daple具有不同于Girdin的特殊功能。Daple在Wnt经

4、典途径中抑制B．catenin聚集和T细胞因子(Tcf)的转录活性，起负调节作用。而在非经典Wnt通路中增加蛋白激酶C(PKC)与Dvl互相作用激活Rac蛋白，起正调节作用。目前已知Daple在出生后期细胞迁移中起着重要的作用，Daple可能会影响胚胎发育、血管发生和肿瘤发展。目前哺乳动物Daple的分布表达的仍不明确。因此，全面了解Daple蛋白的功能及分布对于进一步了解相关疾病的发病机制及预后有重要意义。本研究重点是Daple基因的表达分布。材料与方法：通过SA剪接受体技术制作的Daple基因敲除的老鼠购自transgenic公司。出生7天的老鼠(p7；雌性)和8周老鼠(p56；雄

5、性)(野生型老鼠(+／+)同源性老鼠(．／．))用4％PFA灌注，解剖出组织、冰冻、冰冻切片，解冻安装在载玻片上。Daple分布可以通过LacZ染色显示并可以应用原位杂交技术验证LacZ染色的结果。用33p或地高辛标记的DaplecRNA探针(外显子30)。根据daple基因在脑中的分布，进一步对神经进行免疫组化染色，用PGP9．5，GFAP标记，判定daple基因是在神经元或是胶质细胞表达。根据其分布的特点对脑内可能出现的异常酶进行PCR和RT．PCR分析。结果：我们发现LacZ染色的p7和p56的同源性Daple敲除的小鼠在纹状体、脑室室管膜细胞、小脑(大概在皮质上的浦肯野细胞)、

6、海马、嗅球、脊髓、气管、膀胱、毛囊、舌、胃、脾、胰腺、心肌细胞、视网膜、肾乳头和门静脉，beta-geo(Daple启动子介导LacZ和抗新霉素基因融合】表达而野生型小鼠不表达。原位杂交技术也证实了这个结果。我们发现在脉络丛和海马CA3区，Daple在神经胶质细胞中表达，而在纹状体中，Daple同时在胶质细胞和神经细胞中表达。酪氨酸羟化酶(TH)RT．PCR和realtimePCR的结果显示同源性Daple敲除小鼠和野生型小鼠在酪氨酸羟化酶表达中并没有显著性差异。结论：我们成功的描述出Daple的基因表达。Daple在脑、脊髓、眼、膀胱上皮及平滑肌、支气管上皮、胃、。肾脏、睾丸、输精管

7、、毛囊、舌、门静脉表达显著。Daple4在小鼠脑中的分布主要在纹状体、海马、齿状回、皮质、黑质和室管膜细胞上。在脉络丛和海马CA3区，Daple在神经胶质细胞中表达，在纹状体中Daple同时在胶质细胞和神经细胞中表达。通过酪氨酸羟化酶PCR的结果显示同源性Daple敲除小鼠和野生型小鼠在酪氨酸羟化酶表达中并没有显著性差异，提示同源型敲除小鼠中多巴胺含量与野生型小鼠区别不大。希望通过了解Daple在小鼠全身器官、中枢神经系统分布情况，可以更清楚地