严重烧伤后大鼠骨髓“巨核细胞被噬现象”机制的实验研究

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1、第三军医大学硕士学位论文严重烧伤后大鼠骨髓“巨核细胞被噬现象”机制的实验研究摘要本室前期研究发现，单纯放射损伤、严重烧伤和烧冲复合伤的大鼠、犬骨髓巨核细胞退变，中性粒细胞进入巨核细胞胞浆内将其噬食，命名为“巨核细胞被噬现象”(megakaryocytophagia)，并认为这是严重创伤时血小板数量减少、功能降低的主要原因之一。血小板数量和功能的降低是引发机体出血、感染、多器官功能衰竭的重要因素，是严重创伤救治的关键环节。但巨核细胞被噬现象的发生是中性粒细胞发挥清除机体退变细胞的功能，还是巨核细胞受

2、损后发出某种信号吸引中性粒细胞前往，何种细胞占主导地位，未见有文献报道。关于巨核细胞体内有粒细胞或其他’血细胞的现象早有文献报道，但对其性质、发生机理和意义有不同的看法。有观点认为巨核细胞体内的其它细胞与巨核细胞是共生的，两者独立存在、没有任何关系；有人认为巨核细胞体内的红细胞是两者的重叠；还有人认为巨核细胞有游移的能力，能主动将其它细胞包绕入体内等等。近年来，巨核细胞体内存在其它血细胞的现象更加引起学者们的关注。在血小板减少性紫癜的动物模型、特发性骨髓纤维化病人的骨髓活检及骨髓纤维化动物模型、转

3、染血小板生成素(TPO)的小鼠、核转录因子GATA一1低表达的小鼠等情况均发生不同程度的进入巨核细胞的中性粒细胞数量增加；同时伴有外周血血小板数量减少的现象。巨核细胞是血小板生成的前体细胞，巨核细胞的病理改变及其机能状态直接影响到血小板的产生与补充；因此，研究巨核细胞在疾病和损伤情况的改变具有十分重要的意义。本实验首先以30％Ⅲ度烧伤大鼠为动物模型，较为系统地观察了严重烧伤后骨髓“巨核细胞被噬现象”；利用在体实验观察了严重烧伤后调控巨核细胞增殖、分化和不同成熟阶段生长因子的表达变化；同时利用体外T

4、rallswell穿膜等实验观察了正常和严重烧伤后大鼠骨髓巨核细胞与中性粒细胞的迁移、游走情况，重点观察巨核细胞特异性分泌、对中性粒细胞又有特异性趋化作用的细胞因子一中性粒细胞激活肽2(N舳．2)‘的变化；旨在阐明严重创伤后“骨髓巨核被噬现象”可能发生的机制。主要的方法和结果如下：6第三军医大学硕士学位论文(一)骨髓组织切片观察：正常大鼠骨髓中有大量有核细胞，可见处于不同成熟期的巨核细胞，很少见巨核细胞被噬食；30％III度烧伤后24h骨髓腔充血明显，巨核细胞退变，部分巨核细胞胞浆溶解；退变的巨核

5、细胞被中性粒细胞包绕、食噬，呈“虫蚀样”改变。采用NAP．2和CD．15分别标记巨核细胞和中性粒细胞，可见深紫色的中性粒细胞在红色的巨核细胞体内。(二)烧伤后调控巨核细胞增殖、分化和成熟的细胞因子表达变化PF一4和NAP．2是巨核细胞分泌的特异性蛋白。正常组PF一4主要分布在较为幼稚的巨核细胞胞浆，成熟巨核细胞表达量较低；烧伤后24hPF一4在巨核细胞的表达明显减弱；烧伤后15dPF．4在巨核细胞的胞浆表达增加，明显高于烧伤后24h组，但仍低于正常组。NAP．2在正常巨核细胞胞浆、胞膜表达均为阳性

6、；烧伤24hNAP．2表达明显减弱；烧伤后15d表达增加，强于烧伤后24h组，但弱于正常组的表达。TPO和IL．3是巨核细胞增殖和分化的正调节因子，TGF—B1和P．seletin是其负调控因子。TPO主要分布在较为正常成熟的巨核细胞胞浆和胞膜；烧伤后24hTPO在巨核细胞的表达降低；．烧伤后15dTPO表达仍低于正常组和烧伤后24h组。烧伤后24hIL一3在骨髓细胞的表达与正常对照组相比降低，15d时仍较低。正常巨核细胞胞浆和胞膜均表达TGF．Bl；烧伤后24h在巨核细胞的表达略有下降，无统计学

7、差异；烧伤后15d表达减弱，与正常组比较有统计学意义。P．seletin在正常巨核细胞胞浆和胞膜均表达；烧伤后24h表达下降；烧伤后15d表达弱于正常组和24h组。GATA．1和NF．E2分别参与了巨核细胞早期增殖和晚期分化成熟。GATA．1在正常骨髓幼稚和成熟巨核细胞的胞浆和胞核表达；烧伤后24hGATA．1在较幼稚的巨核细胞表达明显减弱，而在体积较大形态易于辨认的成熟巨核细胞表达阳性，主要分布在胞浆和胞核；烧伤后15dGATA一1在幼稚和成熟巨核细胞的表达均减弱。与正常对照组相比，烧伤后24h

8、NF—E2表达减弱，烧伤后15d表达仍弱于前两者。(三)烧伤后巨核细胞超微结构的改变扫描电镜观察：正常大鼠骨髓巨核细胞呈圆形，表面光滑，烧伤后24h巨核细胞呈不规则形状，表面不平整，呈现出“珊瑚样”改变。透射电镜观察：正常大鼠骨髓巨核细胞胞浆有丰富的线粒体、内质网和成熟颗粒，胞核呈分叶，染色质呈细颗粒状弥散分布，烧伤后24h巨核细胞胞浆细胞器减少，有局灶样坏死，并可见中性粒细胞伸出“伪足”进入到巨核细胞的胞浆中，核皱缩，染色质浓缩边集。7第三军医大学硕士学位论文(四)烧伤后中性粒细