bmp-2和bmscs结合n-han-ldig复合材料修复兔桡骨缺损的实验研究

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1、中图分类号R6UDC61O博士学位论文学校代码10533密级公五BMP．2和BMSCs结合n．HA／n．LDIG复合材料修复兔桡骨缺损的实验研究Ex["totalstudyonrepairmenofrabbitLdialExoerimentalstudyOnairmenolrabbitradialbonedefectsusingBMP--2andBMSCscombinedwithn··HA／n·-LDIGcompositematerial作看姓名：吴凯学科专业：临床医学研究方向：外科学(脊柱外科)学院(系、所)：湘雅医院指导教师：邓展生教授答辩委员会主席多蚁中南大学2013年5月原创性

2、声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：日期：皿乒年』月擎Et学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术

3、信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签导师签名数日期吐年上月毕日博士学位论文中文摘要摘要第一章兔骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及诱导分化成骨细胞目的：探讨兔BMSCs的分离、培养、鉴定及向成骨细胞诱导分化的方法，探讨BMSCs在体外增殖，定向分化能力。方法：取兔股骨的骨髓冲洗液，采用Percoll分离液密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离、培养、纯化兔BMSCs，光镜下观察传代细胞生长状况和形态变化；MTT法检测细胞增殖情况，绘制生长动力学曲线；HE染色形态观察和流式细胞仪抗体鉴定兔BMSCs表面标记物；体外诱导P3BMSCs向

4、成骨细胞分化，对诱导分化为骨细胞进行Gomori钙钴法ALP染色和茜素红钙矿化结节染色鉴定向成骨分化的能力。结果：所分离培养的细胞形态均一，沿胞体长轴生长，呈旋涡状、网状、梭状、放射状，形成较典型的BMSCs。P3BMSCs的生长曲线大致呈S型，第7～11天细胞处于高速增长期，细胞数量迅速增加；HE染色BMSCs形态呈长梭形或长三角形，细胞核浆比例大，核蓝染，胞浆丰富红染。流式检测细胞表面标记物显示BMSCsCD44表达百分率为98．63％，呈阳性，而CD45表达呈阴性。P3BMSCs在体外经成骨诱导3周后，Gomori钙钴法染色ALP呈阳性，胞浆显示有灰黑色颗粒或棕黑色或黑色沉淀。茜

5、素红染色呈阳性，细胞间出现致密的圆形或者卵圆形矿化结节。结论：应用Percoll分离液密度梯度离心法和贴壁筛选法结合能分离、培养出兔BMSCs，是一种比较理想获取兔BMSCs的方法；兔P3BMSCs纯度较高和良好的增殖能力，具有向成骨细胞定向分化的生物学特性，是组织工程理想的种子细胞，也为后续进行骨缺损修复实验奠定了坚实的基础。关键词：骨髓间充质干细胞，分离，分化，成骨细胞博士学位论文中文摘要第二章n．HA／n．LDIG复合材料的制备及与BMSCs体外复合培养的细胞生物学评价目的：以赖氨酸盐，甘油及n．HA为主要原料，制备出一种新型n．HA／n．LDIG复合材料，分析其与BMSCs体外

6、复合培养的生物相容性，探讨其作为组织工程支架的可行性。方法：选择赖氨酸盐和甘油为原材料，通过有机合成、聚合反应、纳米化、超临界抗溶剂结晶、超声分散等技术制备出n．HA／n．LDIG复合材料。电镜观察其结构及计算孔隙率，细胞计数法检测细胞对复合材料的黏附能力，MTT法检测复合材料对细胞增殖的影响，ALP活性和钙含量测定观察复合材料对细胞分化的影响。结果：n．HA／n．LDIG复合材料肉眼为白色散在，为比较均匀的粉状固体。扫描电镜可见类似天然松质骨的三维孔洞网络结构，透射电镜可见排列不规则的晶须和空穴。共培养从2h至10h，随时间细胞的黏附率有所增加，其中6h时细胞黏附率明显高于4h时，8

7、h时明显高于6h时，其差异均有统计学意义(P