氧糖剥夺复氧(ogdr)模型中golph3介导高尔基体应激(gas)的相关机制研究

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1、中图分类号——UDC博士学位论文学校代码!Q533密级公珏氧糖剥夺／复氧(0GD瓜)模型中GOLPH3介导高尔基体应激(GAS)的相关机制研究StudyofGOLPH3MediatedGolgiapparatusStressinOxygen--GlucoseDeprivation／ReoxygenationModel作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：李婷临床医学神经病学湘雅二医院胡治平教授博士学位论文原创性声明IUlIIIIIIUlIIIIlY2424397本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中

2、特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：别磁名辱博

3、士学位论文中文摘要氧糖剥夺／复氧(OGD瓜)模型中GOLPH3介导高尔基体应激(GAS)的相关机制研究研究背景及目的：氧化应激在脑缺血后神经元的损伤中起关键作用，是造成脑缺血再灌注损伤的主要因素。随着疾病的研究深入到亚细胞水平，越来越多的研究证实与亚细胞器相关的细胞死亡是一个值得重视的领域。内质网、线粒体及溶酶体等在氧化应激相关细胞死亡中的主导作用已得到广泛认可及深入研究。近年来，针对高尔基体在氧化应激中的研究发现，同线粒体及内质网相似，高尔基体也能够感知并传导氧化应激信号即高尔基体应激(GolgiApparatusStress，GAS)。通过发现并阻断不恰当的GAS将成为

4、防止或治疗氧化应激相关神经系统疾病的研究热点。虽然GAS与疾病的研究已经得到了越来越多的重视，针对高尔基体在氧化应激中的作用也已经进行了一系列卓有成效的研究，但目前仍处于初期阶段，缺乏可以检测并评估的相关因子。如内质网应激过程中，可以检测到伴侣蛋白GRP78表达的上调、蛋白水解酶Caspase．12及促凋亡编码基因CHOP等的激活以及线粒体应激中，活性氧基ROS的生成、线粒体膜电位的改变、细胞色素C的释放以及Bcl．2家族因子的变化等等。我们推测在氧化应激所诱导的GAS过程中，也存在与其功能及结构调适相关联的因子或基因，能够提示GAS的存在，动态反映应激水平，并受其他细胞T

5、T博士学位论文中文摘要器信号通路的影响，或者在高尔基体自我适应失败后能直接触发特异性凋亡通路。该因子应该具备以下特点：①来源于高尔基体，具有与高尔基体功能密切相关的活性；②在氧化应激作用下能迅速反应性上调，并随应激水平的改变而发生变化；③对高尔基体的功能或下游凋亡信号有直接影响。GOLPH3是一类新的高尔基体外膜蛋白，具备成为GAS相关因子的潜质。因此，本研究的目的旨在利用体外细胞氧糖剥夺复氧(OGD瓜)模型探索在脑缺血再灌损伤中，GOLPH3与氧化应激的关系，对高尔基体结构及分泌功能的影响，是否对高尔基体、内质网、线粒体应激及凋亡、白噬通路产生影响；进一步完善高尔基体应激

6、学说的理论基础。研究方法：1．培养小鼠神经细胞瘤N2A细胞，建立氧糖剥夺再灌注(OGD／R)模型，并采用光学显微镜、酶学检查等评价OGD／R模型；2．实验分为正常对照组、普通OGD／R组、保护性药物干预后OGD／R组，细胞毒性药物干预组；其中普通OGD／R组、药物干预后OGD／R组按时间点不同分为4H、12H、24H、48H四个亚组；保护性干预药物为抗氧化剂N．乙酰半胱氨酸(N—acetylcysteine，NAC)以及内质网应激特异性阻断剂4．苯基丁酸钠(4-phenylbutyrateacid，4-PBA)；细胞毒性药物为能造成钙超载的毒胡萝卜内酯(Thapsigarg

7、in，TG)及N一甲基一D一天冬氨酸(NMDA)；3．Westernblot检测各组中GOLPH3，GRP78，LC3I、II亚基，博士学位论文中文摘要p75NTR的蛋白表达变化；4．RNA干扰技术抑制GOLPH3表达，ShRNA的筛查及载体转染；5．流式细胞仪测定各组中细胞凋亡率的变化(AnnexinV-FITC／PI)；6．荧光法(DCFH—DA)测定各组中ROS生成的变化；7．ELISA法检测细胞上清BDNF浓度；8．免疫荧光共聚焦方法观察GOLPH3的细胞亚定位及变化。结果：1．OGD／R后细胞形态的变化、