microrna-21在大鼠心肌缺血再灌注早期的抗凋亡作用及机制

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1、中图分类号UDCR541．4610博士学位论文学校代码密级10533公开microRNA．21在大鼠心肌缺血再灌注早期的抗凋亡作用及机制Theeffectandmechanismofanti—apoptosisofmicroRNA一21inratmyocardiumduringearlyphaseofischemia—repersusion作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：杨琼临床医学内科学湘雅三医院杨侃教授论文答辩日期扣

2、；-s．话+答辩委员会主席中南大学2013年5月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了

3、论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：袖泳日期：业m．c-月卫日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。日期：

4、护B年、i一月{。日microRNA一21在大鼠心肌缺血再灌注早期的抗凋亡作用及机制摘要目的：细胞凋亡是缺血再灌注(ischemia—reperfusion，I／R)损伤的重要环节，抑制细胞凋亡可以防止或减轻I／R损伤。文献报道microRNA一21(miR一21)在I／R动物模型表达异常，本研究探讨miR一21在I／R早期表达异常是否与细胞凋亡相关及其可能机制。曲美他嗪(trimetazidine，TMz)是经典抗缺血药物，本研究还将探讨TMZ在I／R早期抗细胞凋亡作用是否由miR一21及其靶基因介导。方法：1．体内实验：48只SD大鼠随机分为假手术(Sham)、I／R2h、I／R4h、I

5、／R6h组，每组12只大鼠。Sham组大鼠仅开胸，其余组分别开胸结扎前降支45分钟后再灌注2h、4h、6h。比较各组的细胞凋亡水平及miR一21水平，以Bcl一2／Bax、Caspase一3为心肌细胞凋亡指标。HE染色观察心肌组织形态结构，Westemblot方法检测Bcl一2／Bax、Caspase一3的蛋白水平，RealtimePCR检测miR一21变化。2．体内miR。21过表达实验：成功构建重组腺相关病毒rAAV9一ZsGreen—pre—miR-21及空A对照病毒，滴度为5．O×1012vg／ml。30只SD大鼠，随机分为①对照组：大鼠转染空白病毒；@miR一21组：大鼠转染rAA

6、V9一ZsGreen—pre—miR一21；@Sham组：大鼠转染空白病毒后开胸；@I／R组：大鼠转染空白病毒后I／R2h；@I／R+miR-21组：大鼠转染rAAV9一ZsGreen—premiR一21后I／R2h。以PTEN／AKT通路作为拟验证的miR一21的下游通路。比较过表达miR一21后绌胞凋亡水平及miR一21下游通路水平变化。RealtimePCR方法检测miR一21、PTENmRNA水平，免疫组化观察缺血区Bcl一2、Bax、Caspase一3的表达，Westernblot方法检测缺血区凋亡指标水平及下游通路PTEN、P—AKT的蛋白水平。3．体外实验：用Lipofecta

7、minelM2000将30nM，50nM，100nM的miR一21抑制剂(inhibitors)及30nM，50nM，100nM的miR一2l模拟物(mimics)转染H9C2细胞，摸索最佳转染浓度。将细胞随机分为@VehicleControl(VC)、②抑制物阴性对照(inhibitorsnegativecontrol，INC)、⑧模拟物阴性对照(mimicsnegativecontrol，MNC)、④缺氧．复氧(hypoxia—reoxygenation，H／R)+VC、@H／R+INC、@H／R+MNC、@H／R+inhibitors、@H／R+mimics。H／R处理为低氧培养4小时

8、后常氧培养3小时。比较正、负调控miR一21表达时miR一21、下游通路PTEN／AKT水平及细胞凋亡水平的变化。RealtimePCR检测miR．21。PTENmRNA水平，Westernblot方法检测Bcl一2／13ax，Caspase．3，PTEN，P．AKT的蛋白水平，流式细胞仪检测细胞凋亡。4．体外TMZ抗凋亡实验：H9C2细胞随机分为Control、H／R+Control、H／R+TMZ组；同时