肾胺酶对sd大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究

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1、万方数据中图分类号UDCR541．3610硕士学位论文学校代码10533密级公开肾胺酶对SD大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究TheeffectandmechanismofRenalaseonSpragueDawleyratswithmyocardialischemiareperfusioninjury作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：李小刚临床医学内科学湘雅三医院蒋卫红教授论文答辩日戡丑}垂：[!幽答辩委员会主席中南大学2014年5月万方数据学位论文原创性声明本人郑重声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽

2、我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。作者签名：红：!型日期：碰年工月盟日学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、

3、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名：粗日期：巡年工月丛Et导师签名此日期：巡年』月生日万方数据肾胺酶对SD大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究摘要目的：研究在心肌肾胺酶缺乏、肾胺酶正常表达及肾胺酶重组蛋白预处理三种条件下，SD大鼠心肌缺血再灌注(I／R)损伤、细胞凋亡程度及组织肾胺酶表达变化，初步探索肾胺酶在心肌缺血再灌注损伤中的作用及其可能机制。方法：1．细胞实验：慢病毒载体介导的肾胺酶基因沉默干扰序列(LV-Rnls．RNAi)转染H9C2心肌细胞，运用QPCR及Western—Blot方法鉴定肾胺酶基因表达抑制效率，筛选出

4、对肾胺酶基因有高效抑制的靶序列。2．SD大鼠心肌细胞肾胺酶基因沉默模型建立：15只SPF级雄性10周龄SD大鼠(280．3209)，平均随机分为5组(分别为0d组、4d组、7d组、10d组、14d组)；除基线组(0d组)外，每只大鼠心包腔注射100ul方法1中筛选出的滴度为1E+8TU／ml的慢病毒，分别在第0天(0d组)、4天(4d组)、7天(7d组)、10天(10d组)、14天(14d组)处死对应各组大鼠，QPCR及Western—Blot方法鉴定心肌肾胺酶表达，选取最佳感染时间。3．心肌缺血再灌注(I瓜)损伤模型：36只SPF级雄性10w龄SD大鼠(280．32

5、09)，平均随机分为6组，分别为肾胺酶基因干扰组(RNAi组)、肾胺酶基因干扰阴性病毒对照组(RNAi．NC组)、正常手术组(Normal组)、假手术组(Sham组)、肾胺酶重组蛋白预处理组(Protein组)、蛋白溶媒(PBS)预处理组(Vehicle)。I／R模型建立方法为结扎左冠状动脉前降支45min，再灌注24h；其中RNAi组及RNAi．NC组在I／R术前10天按方法2中建立肾胺酶基因沉默模型；Protein组及Vehicle组分别术前10min皮下注射肾胺酶重组蛋白(1．5mg／kg)及同体积PBS；Sham组穿线不结扎。采用Elisa检测术前、术后血浆肾

6、胺酶及去甲肾上腺素(NE)变化；双染色法测定心肌坏死及梗死面积；TUNEL方法检测细胞凋亡；QPCR及Western．Blot方法检测心肌组织肾胺酶表达。结果：1．细胞转染后LV-Rnls—RNAi(19810．1、、LV-Rnls．RNAi万方数据(19811．1)、LV-Rnls—RNAi(19813—1)三组较对照组，肾胺酶基因表达明显下降，差异有统计学意义(P<0．05)，各自抑制效率分别为63．47％、32．69％、93．66％，进一步检测LV-Rnls．RNAif19813．11转染组蛋白表达抑制效率为83．1％。2．心包注射慢病毒前后，大鼠血压、体重等各

7、组间无统计学差异(P>O．05)，转染术后第10d、14d明显肾胺酶基因表达较0d明显降低(P<0．05)，第10d与14d之间比较无统计学差异(P>0．05)，进一步检测第10d组大鼠心肌细胞蛋白表达抑制效率为63．89％。3．(1)各组大鼠I／R术前及术后，血压、体重各组间无统计学差异(P>0．05)。I瓜术后双染色法显示各组缺血区面积比较差异无统计学意义(P>0．05)；各组坏死面积比较RNAi．NC组、正常手术组及Vehicle组之间差异无统计学意义，P>0．05(n=3)，RNAi组及蛋白预处理组分别与各自对照组相比有显著性差异，P<0．0