罗非鱼gata-2和p450(11β)基因克隆、表达及在性腺分化和配子发生中作用的初步研究

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1、西南大学硕士学位论文罗非鱼GATA-2和P450（11β）基因克隆、表达及在性腺分化和配子发生中作用的初步研究姓名：张未丽申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：王德寿200906捅婴曼皇曼蔓曼曼曼曼量曼皇曼量曼曼皇曼曼曼曼舅舅鼍曼曼曼曼IIII舅曼曼曼曼皇曼皇皇曼曼曼量曼曼曼量曼曼曼皇曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼舅曼曼笪曼曼皇曼罗非鱼G么尉．2和P450(1lfl)基因克隆、表达及在性腺分化和配子发生中作用的初步研究水生生物学专业硕士研究生张未丽指导教师：王德寿教授摘要GATA是一类具有保守的锌指结构域的转录因子，其家族成员具有2个C-X2￡-X17-C-X2．C(C为

2、半胱氨酸，X为可变氢基酸，数值为氨基酸个数)锌指结构。可根据GATA因子两个锌指的位置不同而命名为氨基(N)端和羧基(C)端锌指：前者具有协同其他转录因子、增强转录因子与DNA序列相结合的稳固性和特异性的功能：后者主要结合位于靶基因启动子和增强子部位上一段共同的核苷酸序列[T／A(GATA)A／G]，因而这类转录因子被命名为GATA转录因子。GATA家族由6个成员组成，分别为GATA．1至GATA-6。其中，GATA-2对外胚层和中胚层的发育至关重要。而最新研究表明，GATA-2不仅存于胚胎器官，还对成体造血系、神经系统、垂体和泌尿生殖系统中细胞的功能和维持都必不可少。硬骨鱼类在进化

3、上经历了一次特有的基因组复制，许多在四足类只有一个拷贝的基因，却在硬骨鱼类有两个拷贝，而目前在Oera3ankA公布鱼类GATA-2只有斑马鱼、青鲻和三刺鱼各一个GATA-2基因，硬骨鱼类可能存在两个GATA．2这一现象目前还未见报道，正是基于此，本研究通过生物信息学分析的方法，分别从东方纯(fugu)、河纯(tetraodon)和青鳝(medaka)基因组中分离得到由不同基因编码的两个GATA-2(分别命名为G■尉．知和G彳尉一2b)，此外，为了在一个物种同时克隆得到两个GATA-2，并进一步研究它们的表达模式和功能，通过RT-PCR和RACE相结合的方法，从罗非鱼克隆得到了GAT

4、A-2a和G■尉．26eDNA序列。罗非鱼G，4勿．知的cDNA为2035bp，包括3’端非编码区(UTR，untranslatedregion)为673bp，开放阅读框为1389bp，编码462个氨基酸。GATA一2b的eDNA全长为2483bp，其中5’-UTR为352bp，3'-UTR为766bp，开放阅读框为1365bp，编码454个氨基酸。用上述从基因组中本研究分离得到和已公开物种的GATA．2序列构建进化树，该树基本能反映个物种的进化关系。结果表明罗非鱼的GATA．2a和GATA-2b都聚类于硬骨鱼类的GATA．2分枝，其中，罗非鱼GATA．2a和从基因组中分离得到鱼类的

5、GATA02a聚类于一个亚枝，罗非鱼GATA一2b和从基冈组中分离得到鱼类的GATA．2b聚类于另一个亚枝。此外，我们通过RT-PCR方法对罗非鱼GATA．2a和GATA一乃在各组织的表达模式进行了两南大学硕+学位论文研究。发现罗非鱼GATA．2a在脑、垂体、卵巢和鳃表达，而GH尉·2b仅在垂体、卵巢和鳃表达，且两者在性腺的表达都具有明显的性别二态性(只在卵巢表达，而不表达于精巢)。进而，为了研究两个G■勿．2的性别二态性表达是否受到外源性激素的影响，实验了用MT(雄激素甲基睾酮)，F(雌激素合成酶抑制剂)，TAM(雌激素受体拮抗剂)和E2(雌激素)药物处理罗非鱼导致完全性逆转，并检

6、测八个月大的罗非鱼发现GATA-2a和一2b都表达于性逆转的雌鱼(XY)，而在的性逆转的雄鱼(XX)中检测不到表达，结果与对照组刚好相反。证明GATA．2a和．拍的表达与基因型无关，只与表型(雌性卵巢)相关。为了确定罗非鱼两个GATA．2基因的细胞表达类型，用原位杂交的方法分别检测了两个基因在卵巢，脑和垂体中的表达，结果显示GAlA．2a和一乃都表达于卵巢的颗粒细胞、鞘膜细胞和间质细胞及腺垂体中细胞(具体细胞类型未确定)，而GATA-2a还表达于脑的血细胞及血管附近的细胞。初步结果表明它们具有基本相同的组织分布和细胞表达类型，只是略有差异，暗示其功能也可能不完全一致。在多种硬骨鱼类中

7、已有的研究都证明了11．酮基睾酮(1l-ketotestosterone，11．KT)是重要的雄激素之一，而P450(1lfl)编码的11B羟化酶是11-KT合成途径中的关键酶。本研究从尼罗罗非鱼中克隆得到了两种选择性剪切形式的P450(1Ifl)，分别命名为P450(1lfl)一，和．2，它们的开放阅读框分别长为1614bp和1227bp，编码537和408个氨基酸。P450(1lfl)．J基因含有9个外显子，而与P450(1lp)．J不同的是，P450