神经生长因子受体trka与胞内信号分子mint2相互作用的研究

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1、第二军医大学硕士学位论文神经生长因子受体TrkA与胞内信号分子Mint2相互作用的研究姓名：张骐申请学位级别：硕士专业：神经生物学指导教师：何成20040501苎二兰堕查兰堡!．兰堡笙苎!蔓皇丝曼I英文缩写Muncl8interactingproteinsMuncl8相互作用蛋白PDZdomainPostsynapticdensity一95／DiscsPDZ结构域large／Zonaoccludens一1PTBdomainPhosphotyrosinebindingdomain磷酸化酪氨酸结合结构域PCRcDNAbpAmDAPSDSTEMEDPAGEGSTI

2、PTG丁hrPTKNGFTrkAIPIBPolyasechainractionComplementaryDNABasepairAmpicillinAmmoniumPersulfateSodiumDodecylSulfate聚合酶链反应互补DNA碱基对氨苄青霉素过硫酸铵十二烷基硫酸钠N，N，N，N—Tetramethylethylenediamine四甲基乙二酸Rotateperminutes每分钟转速Polyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳Glutathions-transformase谷胱甘肽．S转移酶Isopro

3、pylB—D—Thiogalactoside异丙基一硫代一B—D-半乳糖苷arginine精氨酸asparagmetvmslneprolmemethionineG1utaminethreonineProteinTyrosineKinase天冬酰胺酪氨酸脯氨酸甲硫氨酸谷氨酰胺苏氨酸酪氨酸蚩白激酶Nevergrowthfactor神经生长因子NevergrowthfactorreceptorTrkAimmunoprecipttationimmunoblotting神经生长因子受体免疫共沉淀免疫印迹鼬m¨盼㈨∞；((((她蛔研№曲第一军医大学硕士学位论文11中英文

4、摘要神经生长因子受体TrkA与胞内信号分子Mint2相互作用的研究摘要NGF是最早发现的神经营养因子，它的作用除促进发育中的交感、感觉神经元分化、成熟、维持成年期的生存等功能外，还可阻止成年神经损伤后死I：：。Tr】姐是NGF的高亲和力受体，分子量为140kDa，膜内域具有酪氨酸蛋白激酶活性。TrkA在NGF作用下发生二聚化，使胞内域中酪氨酸激酶区激活，从而使TH出中酪氨酸自磷酸化，并进一步激活胞内信号转导通路，从而实现神经营养信号传递。本实验室以往研究显示，运用酵母双杂交方法筛选人脑LexAcDNA文库，发现胞内信号分子Mint2可能与神经生长因子受体Tr

5、kA的胞内域相互作用。信号分子Mint2属于Mint胞浆蛋白家族，目前Mint家族已有三个成员，即Mind、2、3。Mintl、2仅在神经组织中表达，Mint3分布广泛，且Mint家族成员均含有一个中央保守的PTB功能域和C端两个PDZ功能域。文献报道，当Mint蛋白在哺乳动物细胞中过量表达时，它们可以增加细胞内[LAPP蛋白的半衰期及其表达水平，并可以改变p．APP的代谢进程。p．APP可经B一和v．分泌酶蛋白水解代谢后形成淀粉样蛋白Ap，AD在老年斑中大量积聚是阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)发病机制淀粉假说的核心。因此，进一步

6、明确TrkA受体与信号分子Mint2的相互作用，对于深入认识Mim2分子的生物学功能，以及深入了解老年性痴呆等神经退行性疾病的发病机制和寻求新的防治手段具有重要意义。本研究主要结果如下：j@TrkA胞内域与LexA蛋白融合构建成的诱饵蛋白质粒pGilda．TrkA“，与构建成的Mjnt2全长及Mint2各结构域-AD融合蛋白质粒pB42AD-Mint2、pB42AD—Mira2一N、pB42AD—Mint2-PTB、pB42AD—Mint2-PDZl、pB42AD—Mint2一PDZ2分别共转化HLY819。共转化子的B一半乳糖苷酶活力检测以及SD／GalU

7、ra"His‘T邛一Leu。平板生长实验发现：在酵母eeMira2一PTB象Mint2全长一样-与TrkAK有较强的相互作用；Mint2．PDZt、Mint2一PDZ2与TrkAK的结合较微弱；而Mint2．N与第二军医人学坝十学位论文中英文摘要TrkA”未见结合。将Mint2一N段以／3lMint2一PTB、Mint2一PDZl、Mint2一PDZ2结构域哑克隆到pGEX-4T3质粒中，构建成Mint2。PTB、Mint2．PDZl、Mint2．PDZ2结构域以及Mint2-N段的GST融合蛋白的表达质粒，利用大肠杆菌BL一21实现融合蛋白的原核表达，利用

8、交联葡聚糖亲和层析法纯化，得到TMint2各个功能域