碳酸钙微球作为p53基因载体的研究

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1、浙江理工大学硕士学位论文碳酸钙微球作为p53基因载体的研究浙江理工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：粥缛日期囝时牛年弓月／0日浙江理工大学硕士学位论文碳酸钙微球作为p53基因载体的研究浙江理工大学学位论

2、文版权使用授权书I㈣燃学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于学位论文作者签名：保密口，在⋯～一年解密后使用本版权书。不保密√霜期：2咖年弓月／pA华碑特狮签名：加讹[-t期：卿年；月／'2-日浙江理工大学硕士学位论文碳酸钙微球作为p53基因载体的研究摘要肿

3、瘤发生多数与基因突变有关，因此，通过基因治疗手段改造或纠正突变基因对于癌症治疗具有重要意义。基因载体的安全性和有效性是实现基因治疗的关键因素之一。研究高效、安全的基因载体是当前研究的焦点。本论文采用化学沉淀法制备出三种不同性质的碳酸钙微球，并将碳酸钙(CaC03)微球作为基因载体，用聚乙烯亚胺(PEI)表面修饰，探究经PEI修饰的碳酸钙微球作为基因传递载体的可能性及其携载重组质粒pEGFP．Cl-p53的体内外抑癌效果。方法：(1)制备三种不同性质的球形CaC03颗粒，通过场发射扫描电镜(SE．

4、FEM)、X射线衍射(XRD)、傅里叶红外光谱(FTIR)以及动态光散射(DLS)等方法对合成的CaC03颗粒形貌、粒径和结晶度等性质进行表征，建立稳定合成碳酸钙微球的工艺路线。(2)采用聚乙烯亚胺PEI对纳米结构的CaC03微球表面修饰。研究表面修饰后的碳酸钙微球携载p53基因转染多种癌细胞和正常细胞(Hep3B、H1299、Hela、QSG-7701和293a)的效果。通过荧光显微镜观察GFP．P53融合蛋白的表达。(3)通过MTT实验研究碳酸钙微球的生物安全性及CaC03．PEI．pDNA

5、复合物的抑癌效果；Hoechst33342染色研究复合物的抑癌机理。(4)构建裸鼠Hep3B肝癌移植瘤模型，瘤内注射碳酸钙载体．基因复合物，探究修饰后的碳酸钙微球的体内抑癌效果，并通过肿瘤组织切片HE染色和TUNEL染色等病理学结果分析抑癌机制。结果：(1)通过添加不同的调控剂，制备出三种不同形貌、晶型及粒径大小的CaC03微球，平均粒径分别为：960nm、976nm和510nn'l。三种颗粒形貌均为球形，分散性良好，粒径分布较均一且表面粗糙度较大。(2)通过研究在不同pH值条件下碳酸钙微球的降

6、解情况，实验结果显示碳酸钙微球在酸性pH下能够更快速地降解，且与其它两种微球颗粒相比，SCa微球的酸性pH依赖性更大。说明碳酸钙微球能够响应酸性pH值，具有pl{依赖性。通过研究不同浓度下碳酸钙微球的生物相容性情况，结果发现在一定浓度范围内三种碳酸钙微球的毒性较低，表明这三种碳酸钙微球都具有良好的生物相容性，且ACa的生物相容特性最佳。III浙江理工大学硕士学位论文碳酸钙微球作为p53基因载体的研究(3)体外细胞实验证实经表面修饰的CaC03微球作为基因载体携载p弱基因能够将基因传递至细胞内并成

7、功表达融合蛋白GFP-P53，有效地抑制癌细胞增殖。(4)体内动物实验结果显示SCa-PEI-pEGFP．C1-p53能有效地抑制肿瘤生长。关键词：基因治疗；碳酸钙微球；表面修饰；p53基因；抑癌效果IV浙江理工大学硕士学位论文碳酸钙微球作为p53基因载体的研究CalciumCarbonateMicrospheresforp53GeneDeliveryAbstractGenetherapyfortumorissignificantlyimportantsincetumorOccursmostly

8、withgeneticmutations．Thesafetyandefficacyofgenecarriertoachievegenetherapyisoneofthekeyfactors．Currently,developinganefficientandsafegenevectorisattractingmuchmoreattention．Inthisstudy，threedifferentpropertiesofcalciumcarbonatemicrosphereswereprepare