玉米赤霉烯酮诱导大鼠leydig细胞凋亡及自噬保护作用

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1、玉米赤霉烯酮诱导大鼠Leydig细胞凋亡及自噬保护作用ZearalenoneinducesapoptosisandcytoprotectiveautophagyinprimaryLeydigcells研究生：王亚军学科：临床兽医学导师：卞建春教授扬州大学兽医学院2014年6月王亚军：玉米赤霉烯酮诱导大鼠Leydig细胞凋亡及自噬保护作用中文摘要玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)是一种非甾体雌激素样作用的霉菌毒素，它广泛存在于世界各地谷类食品中。ZEA具有生殖毒性、遗传毒性和免疫毒性等。然而关于ZEA暴露对雄性动物睾丸间质细胞(Leydigcells)凋亡和自噬的研究报道较少，

2、为探究ZEA雄性生殖毒性的机理，本实验以分离的大鼠原代睾丸间质细胞建立模型，对ZEA在体外诱导Leydig细胞凋亡与自噬、诱导凋亡的信号转导通路以及自噬与凋亡的关系进行了研究。主要研究内容如下：1．ZEA诱导Leydig细胞凋亡。以0，2．5，5，10，20gg／mL的ZEA处理原代Leydig细胞12h，MTT法检测ZEA抑制Leydig细胞的活力影响：Hochest33258染色和透射电镜观察细胞核形态的变化：AnnexinV-F1TC／PI双荧光染色法定量检测ZEA对Leydig细胞凋亡的变化。结果显示，不同浓度的ZEA处理Leydig细胞12h后，细胞活率极显著低于对照组(p

3、．叭)；20I．tg／mL的ZEA处理后12h后，细胞核发生明显的固缩、染色质凝聚等凋亡特征；电子显微镜观察到ZEA处理的Leydig细胞发生染色质边缘化、浓染、核固缩以及包内出现空泡等现象；AnnexinV-FITC／PI双荧光染色流式细胞术检测显示，与对照组比较，ZEA处理组凋亡率显著升高(矽<0．05)，随着ZEA剂量的增加，细胞凋亡率逐渐升高，呈现出一定的剂量依赖性关系。结果表明，ZEA可诱导Leydig细胞的凋亡、抑制Leydig细胞的生长，从而影响睾酮的分泌。2．ZEA诱导Leydig细胞凋亡信号转导通路。以0，2．5，5，10，20p．g／mL的ZEA处理原代Leydig细

4、胞12h，JC一1探针检测线粒体膜电位的变化情况；Westernblot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl一2、Caspase以及PARP的表达变化；Westernblot检测细胞色素c(cytochromeC，Cytc)的释放情况。结果显示，不同浓度的ZEA处理Leydig细胞后，与对照组比较，线粒体膜电位显著降低(正0。05)，随ZEA染毒剂量的增加，线粒体膜电位显著降低，并呈现出一定的剂量依赖性关系；Westernblot检测Bax与Bcl．2结果显示，ZEA处理Leydig细胞后能够分别上调Bax和下调Bcl．2蛋白表达，与对照组比较，在10lag／mL和20gg／mL的ZEA处理组

5、中Bax／Bcl．2的比率明显增加(p<0．05)；不同浓度的ZEA处理Leydig细胞后，与对照组比，线粒体中的cytC表达量下降(p<0．05)并且细胞浆中的cytC表达上调；ZEA处理后，蛋白Capsase．3、Capsase一9和PAPR活化表达上调。结果表明，ZEA通过调控Bcl．2和Bax促使线粒体发生去极化，释放CytC至包浆激活线粒体途径，随后激活Caspase级联反应最终诱发凋亡发生。ll扬州大学硕士学位论文3．ZEA对Leydig细胞自噬的影响。以0，2．5，5，10gg／mL的ZEA处理原代Leydig细胞12h，采用免疫荧光与流式细胞术分析检测吖啶橙(Acridi

6、neorange，AO)染色后Leydig细胞中酸性囊泡的变化；Westernblot检测自噬标志性蛋白LC3和Beclin一1的表达变化；采用免疫荧光和透射电镜分别观察LC3聚点现象和自噬泡的形成。结果显示，不同浓度的ZEA处理Leydig细胞12h后，与对照组比较，细胞中酸性囊泡数量显著增加(p<0．05)；Westemblot分析自噬标志性蛋白LC3和Beclin．1的表达变化显示，不同浓度的ZEA处理组LC3和Beclin一1蛋白表达量显著高于对照组(p<0．05)；免疫荧光观察LC3聚点现象，分析显示，ZEA处理Leydig细胞后出现明显聚点(p<0．05)，电子显微镜观察到Z

7、EA处理的Leydig细胞形成自噬泡等典型特征。结果表明，ZEA能够提高大鼠Leydig细胞的自噬水平。4．白噬在ZEA诱导Leydig细胞凋亡中的作用。ZEA联合自噬激活剂(rapamycin，RAP)和自噬抑制剂(chloroquine，CQ)处理Leydig细胞，Wsternblot检测RAP和CQ分别对白噬蛋白LC3的影响；AnnexinV-FITC／PI双荧光染色流式细胞术检测Leydig细胞凋亡变化。结果显示，ZEA与R