比格犬β--防御素cbd127基因的克隆及表达

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1、万方数据CloningandExpressionofp-defensinGeneCBD127ofBeagleThesissubmittedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomy——FengPei—xiang(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor：YinYan-boQingdao．ChinaJune，2014万方数据本

2、研究由“十二五’’农村领域国家高技术研究发展计划(863)项目(项目编号：2012从101303)提供资助万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。啾躲7易么吩帆伽修加谄关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定

3、，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：导师签名：时间：劲五够年多月彳日时间：砂眦年多月v／犯万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要比格犬p．防御素CBDl27基因的克隆及表达摘要本实验运用分子生物学技术，从比格犬睾丸组织中克隆出CBDl27eDNA片段，并构建pMDl9．T-CBDl27克隆载体和pGEX．6p．1．CBDl27表达质粒，对表达融合蛋白的生物学活

4、性进行了初步研究。1．登陆GenBank，参考犬D．防御素基因CBD127序列(DQ011996．1)，设计1对引物来扩增比格犬p防御素CBDl27基因，提取比格犬睾丸组织总RNA，利用RT-PCR扩增得到CBDl27基因eDNA全长序列303bp。对．PCR产物进行纯化回收，构建pMDi9．T-CBDl27克隆载体。设计带酶切位点引物扩增并纯化CBDl27基因与空载体pGEX．6p一1利用EcoRI／XhoI双酶切纯化后，16℃条件下经T4DNA连接酶连接后转化感受态细胞DH5a，涂布Amp／LB平板，挑取阳性茵落测序，将测

5、序准确的茵液抽提质粒，进行PCR和酶切鉴定，将其命名为pGEX．6p．I．CBDl27。2．将重组质粒pGEX．6p．1．CBDl27转化大肠杆菌BL21(DE3)中，进行IPTG诱导和蛋白的纯化。经SDS．PAGE检测，获得了约36ku的目的蛋白。Western-blot分析表明，重组蛋白获得了表达。微量琼脂平板扩散法检测表达产物体外生物活性，结果显示表达的CBDl27蛋白对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、大肠杆菌(ATCC25922)、粪肠球菌(A=rCC29212)、酵母菌GSll5、白色念珠球菌(ATCC1023

6、1)、沙门氏茵都能有一定的抑菌活性，测得的MIC分别为25．00mg／L、50．00mg／L、25．00mg／L、50．00mg／L、50．oomg／L。对绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌则无抑茵活性。CBDl27融合蛋白经不同温度和酸碱度处理后作用金黄色葡萄球菌，仍有抑茵活性，显示该融合蛋白对温度和酸碱度有一定的稳定性。体外CDV病毒感染Vero细胞后，加入CBDl27融合蛋白处理后，观察后测定TCID50，结果提示，CBDl27融合蛋白对有囊膜的CDV没有抑制作用。综上所述，本研究成功从比格犬睾丸组织克隆出CBDl27目的片段，构建

7、了表达载体pGEX．6p-l—CBDl27，IPTG诱导并纯化出目的蛋白，并初步探讨了纯化蛋白的活性及其理化特性。本论文为防御素在畜牧业上的应用与开发提供了一定的研究基础。关键词：比格犬：

8、B一防御素：克隆：蛋白袁达：抑菌活性：抗病毒活性万方数据青岛农业大学硕士学位论文AbstractCloningandExpressionofp—DefensinGeneCBDl27ofBeagleAbstractUsingmolecularbiologytechniques，WeamplifiedCBDI27eDNAfragmentfrom

9、beagledog’Stesticulartissue，andinsertedthegeneintovector,andfinallybuiltpMDl9-T-CBDl27cloningvectorandpGEX一61>1一CBDI27expressionplasmid．Th