繁缕植物防御素基因smd1克隆及表达的研究

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1、繁缕植物防御素基因SmD1克隆及表达的研究CloningandExpressionofplantdefensinGeneSmD1ofStellariamedia学科专业：食品科学研究生：李兴兴指导教师：韩烨副教授天津大学化工学院2017年5月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

2、学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日摘要植物防御素是组成植物防御体系的基本成分，是碱性富含半胱氨酸的小分子短肽，具有较强的抗真菌活性，可作为新型杀菌剂用于植物病害的防治，也有望用于开发食品防腐

3、剂提高食品的安全性。本文根据繁缕植物防御素基因设计合成目的基因片段作为模版，并根据此基因片段设计合成引物，用PCR扩增出基因片段SmD1。再以质粒pET32a(+)的DNA序列为模板，并设计合成引物，该引物另一端与SmD1互补，PCR技术扩增出硫氧还原蛋白基因片段TRX。TRX和SmD1两个片段重叠延伸PCR扩增成TRX-SmD1片段。将上述扩增得到的TRX-SmD1DNA片段连接到pET22b(+)载体上，转化到大肠杆菌BL21(DE3)。含有重组质粒pET22b(+)-TRX-SmD1的大肠杆菌，IPTG诱导后表达的融合蛋白以可溶性形式存在

4、于胞内和细胞周质内，超声破碎后的上清液经Ni-IDA柱分离纯化得到融合蛋白，甲酸裂解融合蛋白可得到与预期分子量一致的有抗菌活性的防御素SmD1。通过对菌体起始浓度、诱导温度、诱导时间和诱导剂IPTG浓度进行优化，在菌体OD600=0.8，温度25℃，诱导剂IPTG浓度为0.6mmol/L，时间12h时抑菌活性达到最大。将同样方法得到的TRX-SmD1DNA片段连接克隆到pET28a(+)载体，产生重组质粒pET28a(+)-TRX-SmD1，转化入大肠杆菌BL21(DE3)，诱导后可高效表达融合蛋白TRX-SmD1，以包涵体的形式存在。经变性、

5、复性处理后用Ni-IDA柱分离纯化，在200mmol/L咪唑浓度下洗脱得到单一蛋白条带。融合蛋白经甲酸裂解后得到有抗菌活性的多肽SmD1。为实现目的蛋白的高效表达，分别对培养基成分和发酵条件进行单因素优化实验，数据分析后选取葡萄糖浓度、硫酸镁浓度、培养时间三个因素进行响应面实验，结果表明，硫酸镁浓度为1.22g/L、葡萄糖浓度为14.64g/L、培养时间为6.34h时防御素SmD1的抑菌圈最大，产量由优化前的1.21μg/mL提高到1.68μg/mL，提高了36.4%。以灰葡萄孢菌为指示菌，目的蛋白SmD1的最低抑菌浓度为1μg/mL。本论文将

6、繁缕植物防御素基因SmD1克隆到了大肠杆菌，并获得了基因的可溶性表达和包涵体表达，表达产物具有良好的抑菌活性，实验研究为植物防御素的高效生产和开发利用奠定了基础。关键词：繁缕，植物防御素基因，克隆，融合表达，发酵优化IABSTRACTPlantdefensinsareoneofthebasiccomponentofplantdefensesystem.Theyaresmall,cationicandcysteine-richpeptidesandhavestrongresistanceagainstfungal.Soplantdefensins

7、canbeusedasnovelgermicidestoprotectplantsfromdiseases.Also,theyareexpectedtohelpdevelopfoodpreservativesfortheimprovementoffoodsafety.DefensingeneSmD1wasclonedintoE.coliexpressionsystemforheterologousexpression.Inourstudy,wesynthesizedthegeneofStellariamediadefensinSmD1accor

8、dingtoitspublishednucleotidesequence.ThesyntheticplantdefensingeneSmD1wasus