肠出血性大肠杆菌o157h7鞭毛蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

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1、肠出血性大肠杆菌0157：H7鞭毛蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备ProkaryoticexpressionofE．coli0157：H7flagellinproteinandpreparationofmonoclonalantibodiesagainsttheflagellinprotein研究生：吴超导师：徐建生教授教育部创新团队项目江苏省高校优势学科建设工程项目扬州大学2014．6吴超：肠出血性大肠杆菌0157：H7鞭毛蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备肠出血性大肠杆菌0157：H7鞭毛蛋白的原核表

2、达及单克隆抗体的制备研究生：吴超导师：徐建生教授中文摘要IIIIIIIIIIIIIIlltlIIIIIIlY2632271肠出血性大肠杆菌(EnterohaemorrhagicEscherichiacoli，EHEC)O157：H7属于肠杆菌科埃希氏菌属，能引起人类的腹泻、出血性结肠炎(Hemorrhagiccolitis，HC)、溶血性尿毒综合症(Hemolyticuremicsyndrome，HUS)及血栓性血小板减少性紫癜(ThromboticThrombocytopenicpurpura，TTP

3、)等严重疾病，可在动物肠道内长期寄居，对人类的健康及畜牧业危害巨大。其感染流行已经成为全球性的公共卫生问题。对于该病的防范不可懈怠，所以建立一种快速、准确、便捷的诊断检测方法十分必要。H7蛋白为EHEC0157：H7的鞭毛蛋白，决定着大肠杆菌的血清型。有关研究表明，EHEC0157：H7与结肠黏膜上皮细胞或者黏液结合的过程发生在菌体在动物体内定植的早期，而鞭毛在这期间起着物理性的连接点的作用。而其在诱导产生天然的免疫反应的同时可产生前炎症因子，并且可以诱导产生抗原特异性的免疫反应。所以，H7鞭毛全长蛋白

4、在制备特异性的检测抗体时是不可或缺的免疫原。在国内外之前的研究中用类似免疫方法制备的EHEC0157：H7单克隆抗体大多是针对菌体及致病因子等抗原的单克隆抗体，而对H7鞭毛抗原的却不多。大肠埃希菌中含有许多菌体抗原为0157而鞭毛抗原非H7的大肠埃希菌。因此，H7鞭毛抗原的检测对于疑似菌株的鉴定十分重要。单克隆抗体技术在近年来的基础生物医学研究中应用广泛。在疾病的诊断与治疗方面，单克隆抗体成为众多研究者研究中必不可少的工具。在免疫学方面，特异性强、灵敏度高，且能持续地无限量供应是单克隆抗体相比于多克隆抗

5、体的优势。目前单克隆抗体已在医学、农业、食品、环境等众多领域得到广泛运用。本研究通过基因工程方法扩增出EHEC0157：H7鞭毛蛋白的全基因片段，大小为1755bp。将目的片段插入到表达载体pET-28a中，构建重组表达质粒pET-28a．Flic。将质粒导入大肠杆菌E．coliBL21(DE3)，37℃条件下，通过IPTG诱导4h后超声波裂解菌液。扬州大学硕士学位论文2经SDS．PAGE分析，该融合蛋白在大肠杆菌E．coliBL21(DE3)中可以高效表达。表达的His．Flic．H7融合蛋白为预期的

6、66kD，且为可溶表达。通过Western．blot分析知鼠抗His标签单抗可以特异性识别该重组蛋白，说明该融合蛋白具有较好的免疫原性。通过镍柱亲和层析法纯化融合蛋白后免疫BALB／c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合。His．Flic．H7融合蛋白及HiS标签蛋白包被酶标板，常规间接Elisa法筛选出4孔能分泌抗Flic蛋白的细胞株，经2次亚克隆后，获得2株可稳定分泌抗体的细胞株E4、G6。亚类鉴定均为IgM。通过免疫印迹及凝集试验鉴定抗体特异性良好。将2株细胞腹腔注射小鼠，获得腹

7、水后进行抗体效价测，Elisa结果显示效价分别为214和213。抗EHEC0157：H7鞭毛蛋白的单克隆抗体的制备，为建立针对该细菌的特异性强，灵敏度高，简便快速的检测方法奠定了基础。关键词：EHEC0157：H7；H7鞭毛蛋白；原核表达；单克隆抗体吴超：肠出血性大肠杆菌0157：H7鞭毛蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备3ProkaryoticexpressionofE．coliO157：H7flagellinproteinandpreparationofmonoclonalantibodiesagai

8、nsttheflagellinproteinM．D．Candidate：ChaoWuSupervisor：JianshengXuAbstractEnterohemorrhagicEscherichiacoli(EHEC)O157：H7belongingtotheEnterobacteriaceaeEscherichelloa．Itcancausediarrheainhumans、Hemorrhagiccolitis(HC)、Hemolyti