(完整)hiv-p24蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备-8.24修改

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1、HIV-1P24蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备汪龚泽，刘朝奇，杨建林，覃晓琳，吕佰瑞，姚佳红三峡大学分子生物学研究所，湖北宜昌443002摘要：目的：制备HIV-1P24蛋白及单克隆抗体，建立ELISA方法用于检测HIV感染。方法：用PCR方法扩增P24基因，将其克隆到原核表达载体PET-28a（+）中,经大肠杆菌表达并纯化HIV-1P24蛋白。以纯化的P24蛋白抗原免疫Balb/c小鼠，取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,制备能产生P24.单克隆抗体的杂交瘤细胞株,进一步采用Westernblotti

2、ng、ELISA等技术对制备的单克隆抗体进行初步鉴定，建立了P24的ELISA竞争法。结果：原核表达重组质粒在大肠杆菌中能高效表达P24蛋白,并进一步从杂交瘤细胞中选取了能稳定分泌P24单抗的杂交瘤细胞株。应用ELISA竞争法测定的HIV-1阳性病人血浆P24与病毒载量显著相关。结论：成功制备了P24蛋白及特异性单克隆抗体，建立了P24的ELISA竞争法。关键字：HIV-1P24，原核表达，单克隆抗体，ELISAExpressionofHIV-1P24proteinandPreparationofitsm

3、onoclonalantibodiesWANGGONGZE,LIUCHAOQI,YANGJIANLIN,QINGXIAOLIN,LVBAIRUIInstituteofMolecularBiology;ThreeGorgesUniversity;YichangHUBEI443002;ChinaABSTRACT:Objective　ToconstructProkaryoticexpressionplasmidofHIV-1P24,purifyrecombinantHIV-1P24proteinandprepa

4、reitsmonoclonalantibodies.MethodsHIV-1P24cDNAwasclonedintoprokaryoticexpressionvectorpET28a(+)andwasfurthertransformedintoE.coliBL21(DE3).TherecombinantHIV-1P24proteinwasusedtoimmunizeBalb/cfemalemouse.ThesplenocyteswerefusedwithSP2/0hybridomatoproducemon

5、oclonalantibodyagainstHIV-1p24protein.WesternblottingandELISAwerecarriedouttoidentifythemonoclonalantibodyproducedbythesehybridomas.Results　HIV-1P24plasmidwassuccessfullyconstructedandidentifiedbyenzymedigestionandsequencing.HIV-1P24proteinwasexpressedint

6、heE.coliBL21(DE3)andpurifiedbyaffinitychromatography.AftertheimmunizedmurinesplenocyteswerefusedwithSP2/0hybridoma,weselectedhybridomacelllineswhichwereabletoproducemonoclonalantibodiesagainstHIV-1P24stablely.CompetitionELISAassaywasestablishedandthep24pr

7、oteinofHIV-1positiveplasmawassignificantcorrelatedwiththeHIV-1viralload.ConclusionsWesuccessfullyexpressedHIV-1p24andpreparehybridomaswhichcanstablelyproducemonoclonalantibodiesagainstHIV-1P24.KEYWORDS:HIV-1P24;prokaryoticexpression;monoclonalantibody;ELI

8、SAHIV是艾滋病的病原体，主要通过性接触、血液和母婴传播。近年来，HIV感染患者数量一直呈上升趋势。根据卫生部统计，中国自1985年发现第一例艾滋病病人以来，截至2009年10月底，累计报告艾滋病病毒感染者和病人319877例。2009年当年新发艾滋病病毒感染者4.8万人，我国艾滋病疫情形势依然严峻，性传播正在成为主要传播途径[1]。而目前测定血清HIV抗体是诊断HIV感染的常规实验方法,但是测定HIV抗体有局限性:有超过7