靶向notch1的sirna抑制小鼠恶性黑色素瘤细胞增殖的体内外研究

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文靶向Notchl的siRNA抑制小鼠恶性黑色素瘤细胞增殖的体内外研究SilencingofNotchlexpressionbyRNAinterferenceSnDDressesmurinemalignantmelanomacellOr01]teration·l-■lll■一·■andtumorgrowth课题来源：自选项目学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院答辩委员会主席答辩委员会委员齐艳霞罗荣城肿瘤学学术型硕士第一临床学院王远东夏霆吴自勃马冬周五一2014年3月18日

2、广州硕士学位论文靶向Nocthl的siRNA抑制小鼠恶性黑色素瘤细胞增殖的体内外研究硕士研究生：齐艳霞指导老师：罗荣城教授摘要背景：恶性黑色素瘤(MalignantMelanoma，MM)，是起源于神经脊黑色素细胞的恶性肿瘤。近几十年来，恶性黑色素瘤在全球的发病率迅猛升高，成为所有恶性肿瘤中发病率增长最快的肿瘤，年增长率几乎达到3-5％。其中白色人种发病率明显高于其他人种，澳大利亚昆士兰地区和美国的南亚利桑那州为恶性黑色素瘤的高发地区，我国和日本等亚洲国家的黑色素瘤发病率与欧美国家相比相对较低，但近年来其发病率呈迅猛

3、上升趋势。恶性黑色素瘤是世界上恶性程度较高的肿瘤之一，该病起病隐匿，易发生转移，当前已成为发达国家皮肤癌死亡率最高的肿瘤。它的预后因素与年龄、性别、部位、肿瘤的浸润深度、淋巴结转移情况、是否溃疡及手术方式等相关。对于早期的局限性病变，外科手术切除是黑色素瘤的最佳治疗原则，然而术后发生转移的几率大。对于晚期转移性恶性黑色素瘤患者，绝大多数需接受全身性系统治疗，但是黑色素瘤细胞对传统的放、化疗均不敏感，所以寻求治疗恶性黑色素瘤的治疗靶点迫在眉睫。Notch信号通路不仅对正常细胞的分化起作用，而且与肿瘤的发生发展也密切相连

4、，影响肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡等。在哺乳动物中，Notch是由4个受体(Notchl．4)及5个配体(Delta-likel，3-4，andJaggedl．2)组成。这条通路激活是通过Notch受体与相邻细胞表面的配体结合，引起Notch受体细胞外结构的改变，导致Y．分泌酶复合体切割并释放Notch受体胞内区NICD(Notch摘要intracellulardomain)进入细胞核，NICD通过其RAM(RBPJKassociatedmolecular)结构域与CSL(CBF一1／suppressorofhairl

5、ess／Lag一1)蛋白结合导致共抑制复合物解离，并募集共活化分子MAML1(mastermind．1ike1)组成共三聚体，从而启动下游基因的转录。在Notch的4个受体当中，Notchl是在肿瘤组织中最常被检测到的家族成员，对肿瘤的发生发展以及演进的过程起到了关键性作用。值得注意的是，Notch信号通路在肿瘤形成过程中既可以充当促癌基因角色又可以充当抑癌基因角色，主要取决于不同肿瘤以及其不同的发展阶段。近年来对恶性黑色素瘤的研究发现，Notchl呈高表达状态并主要起着促癌作用，Notchl蛋白的高表达和天然活化阻

6、止黑色素细胞正常分化，从而导致黑色素肿瘤的发生，间接参与了黑色素细胞的早期恶变。siRNA干扰技术是近年来基因表达调控的研究热点之一，它是由小分子干扰RNA引发诱导的转录后的基因沉默过程。与传统的肿瘤抑制治疗技术相比，siRNA不仅简单有效，而且能特异地下调细胞中基因的表达。目前，siRNA靶向抑制Notchl基因进而抑制肿瘤细胞生长与增殖的相关现象已在胶质瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、急性T淋巴细胞白血病等肿瘤疾病的研究中得到了证实。但在恶性黑色素瘤中，靶向Notchl基因的siRNA是否也可以下调Notch及其下游

7、信号传导通路来发挥其生物学作用，还需要我们进一步证实。因此，本研究拟用RNA干扰技术来探讨Notchl在恶性黑色素瘤发生发展中的作用。以小鼠恶性黑色素瘤B16F1细胞为研究对象，应用siRNA技术下调Notchl的表达，体外观察其对黑色素瘤细胞增殖的影响；同时，拟将转染后细胞注射至同基因来源的C57BL／6小鼠皮下，观察肿瘤的生长速度及Notchl、增殖活跃性指标细胞核相关抗原飚．67、增殖细胞核抗原PCNA的表达变化，从而明确Notchl在体内对黑色素瘤增殖的影响。目的：1．探讨通过siRNA技术沉默Notchl进

8、而抑制小鼠恶性黑色素瘤生长与细胞增殖的可行性。2．探讨Notchl是否能作为治疗恶性黑色素瘤的靶点，进而为寻求治疗恶性黑色II硕士学位论文瘤的新方法提供理论依据。材料与方法：1．主要的实验材料1．1细胞及实验动物来源小鼠恶性黑色素瘤细胞株B16F1由美国芝加哥大学孟玉茹教授赠与；C57BL／6雌性小鼠，6-8周龄，体质量18-22g，购白南方医