转htnf-α基因在鱼腥藻7120中表达产物的提取及其纯化

《转htnf-α基因在鱼腥藻7120中表达产物的提取及其纯化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、Y937310分类号——UDC——密级——单位代码!Q233甘肃农业大学学位论文转hTNF-Q基因在鱼腥藻7120中表达产物的提取及其纯化ExtractionandPurificationofExpressedProductshTNF．afromAnabaena7120牛黎莉指导教师鄞垂蓥教援(苴肃筮些太堂兰心Z3QQZQ2旌庭基麴援(虫国科堂瞳揎堑婴塞匮!￡塞iQQQ塑2学科专业名称奎芒星虹旦缝萎壁研究方向生塑王程申请学位级别．亟±论文提交日期2Q鳗生§旦2§目论文答辩日期2蝤生§且2旦学位授予时间2Q鳗生§旦!§旦答辩委员会主席评阅人2006年6月望田麴援王丝俊熬

2、援王堕剧副教援”肃农业大学2006届硕I．学位论义Y937310摘要蓝藻属光合自养生长，培养条件简单，成本低廉，只需光、cO。、无机盐和合适的温度就能生长，适于大规模生产。用蓝藻为表达宿主制备hTNF-a口服保健品，可以避免大肠杆菌产生内毒素、表达产物生成包涵体等弊端，能降低下游生产成本。人肿瘤坏死因子一a(humantumornecrosisfactorc【，hTNF．吐)对肿瘤组织和肿瘤细胞有特异的杀伤作用，是迄今为止唯一能够直接杀死肿瘤细胞的天然因子，可能成为极有前景的抗癌药。本文用5L瓶培养转hTNF一旺基因的鱼腥藻7120(Anabaenasp，PCC712

3、0)，进行藻体破碎及一系列处理分离和纯化hTNF—c【，得到了从转基因鱼腥藻中获得一定纯度hTNF．旺的优化条件。实验结果如卜．：1．用装有4LBG一1l培养液的5L大瓶，培养转h丁NF一(1基因的鱼腥藻7120(爿"口baenasp．PCC7120)，90umol／m2．S。光照下培养，其24d时表达量最高，是收集藻细胞的最佳时期。2．通过提取缓冲液及蓝藻细胞破碎方法的筛选，得出hTNF．Ⅱ的最佳溶出条件为：O．05mol／L的pH7．5Tris—HCl缓冲液，NaCl0．2mol／L，EDTA0．01mol／L；超声波法破碎最佳条件：超声功率为800W，间歇时间为

4、1S，工作时间为O．5s，湿藻与破碎液的质量体积比为1：15，总超声时间为8min，超声一次：冻融处理的最佳条件：体积最好<15mL，先在．200

5、C冻存过夜(12h)，融化后离心取上清，然后再在藻体中加入同样体积的破碎缓冲液一20。C冻2h，融化后离心取上清，两次上清合并。3．用温度和盐析对粗提液进行初步纯化，确定出最佳的处理温度为：55。C处．理30min；最佳的盐析条件为：蛋白浓度为1．2～1．8mg／mL，最好接近1．8mg／mL，温度为4～18。C，硫酸铵分级沉淀范围为：30％～60％，pHi6．5；最佳的初步纯化工艺为：将蛋白粗提液先用30％饱和度的硫酸铵

6、处理lh后，然后直接用温度55℃处理30min，12，000r／min离一C,30min，将上清再用60％饱和度的硫酸铵处理1h，12，000r／min离一C,30min收集沉淀hTNF一旺，用上柱缓冲液溶解。其hTNF一0t回收率能达N86．83％，并可将约91．2％的杂蛋白去除，纯度达到4．54％，纯化倍数为9．880。4．离子交换层析：比较了几种离子交换填充柱材料的纯化效果；最后选择什肃农业大学2006届硕Jj学位论业用DEAE—Se：phadexA50，然后又对洗脱液的最佳洗脱NaCI梯度和方式作了筛选。选择出最佳的NaCl洗脱方式为阶段洗脱。能使hTNF一Ⅱ

7、的回收率达N75．67％，纯度达至fJ45．36％，纯化倍数为29．36。关键词：培养，藻细胞破碎，提取缓冲液，纯化，离子交换层析II——堕塑查些查堂!!!!旦塑±兰篁笙壅ExtractionandpurificationofexpressedproductshTNF-afromAnabaena7120Postgraduate：NiuLiliSupervisor：Prof．GuoYorong，Prof．ShiDingjiSummaryCyanobacteriaareautotrophicandoxygenicphotosynthesismicrobe．Itcarlbe

8、aliveundertheconditionoflight，carbondioxide，inorganicsaltandoptimaltemperature,that’stosay，itscultureconditionsaresimpleandeasytocultureinmass．PreparinghTNF—qhealthproducttakenorallywiththehostofcyanobacteria，canavoidthedrawbacksofintrotoxinandinclusionbodiesformation，andsolvet