局灶脑缺血2f再灌注大鼠大脑皮质缺血区c-rel的表达与nbd多肽与电针作用机制的分析

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1、局灶脑缺血再灌注大鼠大脑皮质缺血区c．nl的表达及NBD多肽与电针作用机制的研究摘要背景恢复缺血区血供目前是临床缺血性卒中现代治疗中最有效措施，在一定的时间窗内可抢救梗死周围仅有功能改变的半暗带脑组织，但各种脑缺血／再灌注损伤的存在限制了其在临床中的运用。所以如何防治脑缺血／再灌注损伤成为当前备受关注的问题。免疫性炎症反应作为脑缺血／再灌注损伤性病理过程中的重要成员贯穿始终，其剧烈程度与神经、血管内皮细胞、血脑屏障的继发性损伤密切相关。核因子KB(NF．KB)是调节脑缺血／再灌注后免疫性炎症反应的重要转录因子。炎症信号可以激活biT．r,B，同时NF．r,B又调节炎症相关基因表

2、达。c．rel是NF．vd3家族成员之一，大鼠脑缺血／再灌注可上调c．rel蛋白表达，有研究认为上调的c-rel蛋白可发挥脑保护作用，也有研究认为c—rel的过度活化会加重免疫炎症反应程度。故进一步明确c-rel蛋白对脑缺血／再灌注后炎症反应的影响有其重要意义。NEMOBindingDomain(NBD)多肽是一种渗透性较强的NF．rd3特异性抑制剂，它可阻止IrappaB激酶(IKappaBkinase，IKK)降解IrappaB(IKB)从而抑制NF．rd3入核。NBD多肽干预大鼠局灶脑缺血／再灌注可减少缺血半球损国家自然科学基会项目cNo．30470606)：重庆市卫生局

3、中医药科研项目(NO．2012．2．128)3伤，可利用NBD多肽的选择性保护机制明确c．rel蛋白在脑缺血／再灌注后炎症反应中发挥的作用。祖国医学中的针剌治疗也对脑卒中有确切疗效，在动物实验中证实针刺可调节脑缺血／再灌注后炎症反应、抗脑缺血损伤、改善缺血区循环、保护神经元及改善神经细胞电活动等作用。除了作用于过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR吖)、烟碱样乙酰胆碱胡受体(a7nAchR)、Toll样受体4(TLR4)／NF．rd3等炎症通路外，电针是否还可通过调节c-rel抗炎，明确电针抗炎靶点有其重要意义。目的1．探讨局灶脑缺血／再灌注大鼠早期大脑皮质缺血区胞浆与胞核c-r

4、el表达水平与炎症反应剧烈程度是否相关；2．探讨NBD多肽对局灶脑缺血／再灌注大鼠早期大脑皮质缺血区胞浆与胞核c．rel表达的影响；3．比对电针与NBD多肽对局灶脑缺血／再灌注大鼠早期大脑皮质缺血区炎症的作用，探讨电针对缺血大脑皮质胞浆与胞核c-rel表达的影响及机制。方法采用线栓法将160只250．3009SD大鼠制备为右侧局灶脑缺血(MCAO)／再灌注模型。将大鼠随机分为假手术组、模型组、模型+电针组(EA组)及模型+NBD药物组(NBD组)，再将各组分为再灌注6、12、24和48h四个时间点。NBD组通过侧脑室定位定量注入4山NBD。取“百会”穴(DU20)和“四关”穴(

5、合谷Ll4、太冲LR3)▲为电针刺激穴位。对各组进行Zea-Longa神经功能评分评价神经功能缺损情况，苏木素．伊红(HE)染色观察病理变化，免疫荧光双标c—rel与NF-r,Bp65，WesternBlot分别检测大脑皮质缺血区胞浆、胞核c．rel、胞浆Ir,Bot蛋白水平的表达，荧光定量PCR检测c-telmRNA的表达，凝胶电泳迁移率实验(EMSA)检测胞核内c-rel与DNA的结合情况，ELISA检测缺血区炎症因子IL．10c、IL．1p的含量。勿七蟹耋日术1．神经症状学评分局灶脑缺血／再灌注后SD大鼠于各观察时间点均表现出神经功能缺损，模型组、EA组及NBD组的神经功

6、能评分随着时间渐渐降低；NBD多肽在局灶脑缺血／再灌注后的炎症急性期对大鼠神经行为学改善作用明显(P

7、表达在逐渐降低。模型组、EA组和NBD组胞核均于24h表达高峰，均高于假手术组。EA组及NBD组c．rel蛋白阳性表达比模型组少，而模型组、EA组NF—rd3p65蛋白于12h可见入核，48h明显；4．WesternBlot与假手术组相比，模型组、EA组、NBD组各时间点胞核与胞浆c-rel蛋白表达均较高(P