蜂毒肽与基因变构il-2融合蛋白在毕赤酵母中的表达、纯化及生物学活性研究

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1、蜂毒肽与基因变构IL．2融合蛋白在毕赤酵母中的表达、纯化及生物学活性研究摘要目的构建融合基因蜂毒肽(melittin)与人变构白介素21M．IL．2t88Arg，mAla)】毕赤酵母分泌型表达载体pPlCZaA／M-IL一2(88Arg，晒Ala)，转化毕赤酵母菌GS115。筛选多拷贝阳性菌株，甲醇诱导多拷贝阳性菌株表达融合蛋白，分离纯化该融合蛋白，并进行抗菌及抗肿瘤生物学活性研究。方法以质粒pET-15b／M-IL一2(88Arg，125Ala)为模板，PCR获得目的基因，构建重组载体pPICZaA厂肛肛一2(88Arg，嗡Ala)；通过电转法转化毕赤酵母

2、GSI15；MMH，MDH筛选Mut+表型阳性菌株GSI15；ZeocinTM梯度法及荧光定量PCR法筛选多拷贝转化酵母菌株。阳性转化子经甲醇持续诱导表达，提取卜-清，SDS．PAGE及BCA法检测最佳诱导叫‘间，Westernblot鉴定抗原性及特异性。经硫酸铵分级沉淀法、透析法、镍离子亲和层析纯化融合蛋自；液相测定法研究融合蛋白抑菌活性，CCK一8法检测该融合蛋白抗肿瘤活性。结果成功构建毕赤酵母阳性转化菌株GSI15／M-IL一2(88Arg，125Ala)。经MDH及MMH筛选出Mut+型重组菌株GSl15／M-1L一2(88Arg，技5Ala)。Ze

3、ocinTM梯度法及荧光定量PCR法成功筛选出两株多拷叭转化酵母菌株。SDS—PAGE检测在26kDa左右有明显目的条带，与理论值相符。BCA法测定甲醇诱导120h融合蛋白表达量达到最高浓度814．5mg／L，远远高于该融合蛋白存原核系统中产量。Westernblot鉴定该融合蛋白具有抗原特异性。经硫酸铵分级沉淀法、透析法、镍离子亲和层析法获得纯度为99％的目的蛋白，绎浓缩管浓缩获得浓度为432．5mg／L的目的蛋白5mL。经检测纯化的融合蛋白具有抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长活性，具有较强抑制人卵巢癌细胞SKOV3细胞及Hela的生长增殖的牛物活性。结

4、论成功构建毕赤酵母分泌表达重组载休pPICZaAIM-1L一2(88A1．g，125Ala)，筛选出可以稳定高表达的多拷贝重组菌株，表达产物经纯化，获得具有抑菌活性，抗肿瘤活’陆的高纯度融合蛋白M-H。-2(蹦Arg，125Ala)。为进⋯步研究制器低毒、高效的新型抗肿瘤药物奠定基础。硕士研究生李林(病原生物学)指导教师王斌教授关键词：M—IL-2(SSArg，nSAla)；毕赤酵母；表达；纯化；生物活性㈣ll峭IIIIIJllY2589169High-levelexpression，purificationandstudyofbtoacuvityoffus

5、ionproteinMelittin—IL一2(88Arg，125Ala)inPichiapastorisAbstractObjectiveToconstructexpressionsystemoffusionproteinmelittin—IL一2(88Arg，25Ala)inpichiapastoris，andobtainthehigh—levelexpressionofinterestproteinThenpurifyinterestprotein，andstudythebioactivityofit．MethodThepurposegenewasob

6、tainedthroughPCRtechniquefromtherecombinantvectorofpET-15b／M—IL一2(88Arg，‘25Ala)，andclonedintothevectorpPICZctA．ThesacI-linearizedplasmidpPICZuA／M-1L一2(鼯Arg，’25Ala)wastmnsfomaedinto户pastorisGSl15byelectroporation．ZeocinTMscreenedthepositiveyeaststrains．Theexpressionwasinducedwith0．5

7、％methanolat28℃．pH6．0．ThefusionproteinM-IL·2(88Arg，125Ala)waspurifiedbyammoniumsulfatefractionation．dialysisandNi2+affinitychromatography．ThefusionproteinwasassayedwithSDS．PAGEandWestern—blot．Antibacterialactivityofthepurifiedinterestproteinwasassayedbyliquidturbidityanalysis．CCK-8a

8、ssaywasusedtodetecttheinhi